对于外来体定量和尺寸测量新方法研究
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
循环外来体的确切功能仍未知的很长一段时间。即使是现在外来体的完整路径机制尚不完全清楚。由于外来体携带的抗原，蛋白质和涉及到他们的亲本来源的细胞，它们的功能的细胞 – 细胞信号发送器的RNA（mRNA和miRNA）的主要被给予优先权。
许多不同的方法已经在文献中描述的用于分离和外来体1,2的定量检测。然而，在“金标准”没有达成共识已经达成。与此同时，大多数科学家活跃在切体研究领域的同意，孤立的一致方法非常必要的，以实现更高程度不同的报告和研究报告之间的可比性。
荧光激活细胞分选（FACS）是用于外来体分析3中最常见和普遍的工具。 FACS有奔EFIT即，通过荧光标记，来自不同来源的细胞可以在一个步骤中进行比较。 FACS的主要缺点是，该方法是不够敏感，以确定颗粒小于0.5微米4，而外来体一般是30-120纳米之间在直径为5，甚至更少来测量它们的大小。
扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的其他工具进行颗粒尺寸和外来体的形态学分析。但是，这两个SEM和TEM的缺点是样品的制备是费时，这两种方法涉及劳动密集的步骤和各具有工件生成的一些风险。既不方法适合于高样品通量和几千一个样品的单一颗粒的表征。此外，可以同时或至少分析在非常短的周期进行定量分析，为临床日常其中样品具有通常被难以进行。新一代的技术，现在让我们来分析外来体，恕不另行紧张的筹备工作（ 例如，环境SEM）。这些现代化的技术仍然相当不方便分析含外来体，以确定它们的平均数量和规模分布6大体积悬浮液。
另一个可视化和外来体的分析高度敏感的方法是纳米粒子跟踪分析（NTA）。这种方法利用了物理两种不同的原则。首先，颗粒通过散射当它们被照射激光束的光检测。第二个现象被称为布朗运动，根据该不同的颗粒在液体中的悬浮液的扩散成反比它们的大小。在后一种情况下，该运动也取决于温度和液体的粘度。然而，这样的速度是直接关系到颗粒大小和所使用的NTA。使用软洁具为基础的分析，散射光从单颗粒数字图像记录。散射光斑点的图解和其运动速度提供便利的总粒子数和粒径分布的测定数据。这种技术是对小于100纳米的平均直径的粒子分析特别强大。
大小和浓度测量与ZetaView布朗和电泳运动视频分析显微镜进行。这是一种半自动化的桌面纳米颗粒分析仪对液体样品（以下简称为颗粒跟踪仪）。它由粒子追踪分析仪，以及与用于数据分析的软件的笔记本电脑。异质生物样品是作为适合于这种方法，无机颗粒的更均匀的悬浮液。一种激光散射显微镜用摄像机被用于颗粒的检测和用于OBSErvation他们的行动。而在显微镜轴线是水平的，并聚焦到填充有含有外来体的悬浮液的小区的信道时，激光束是垂直取向的。通过激光散射的光，这是根据90°经由显微镜（ 图1）所记录的数字视频相机照射的粒子。的散射光的强度可以观察粒子大60纳米的直径。在这样一种设置的粒子的亮度不粒度的唯一指示。当没有施加电场，粒子运动只有如下布朗运动并且可以用作用于计算粒径的指标。然而，该仪器还能够在整个小区通道施加电场的。当进行这一领域的潜力，极性和离子电荷的悬浮外来体的级成为他们移动的方向的进一步的决定因素。速度和方向，导致电泳莫相容性直方图。
同时发现，分析分离的外泌体的最佳方法是一个问题，另一个位于从不同的媒体，如血液，腹水，尿，乳汁，羊水或细胞培养基的外来体的有效的隔离。不同的方法已被描述迄今，其基于超速离心1，工业分离试剂（如Exoquick）7，磁珠抗原采用分离8或超滤步骤9。
在这个协议中，我们展示的切体隔离，通过超速离心的全过程，并展示了如何通过分析粒子跟踪仪含停牌产生的切体。提供特定的考虑因素的人血浆或细胞培养基衍生的外来体的分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们证明用于从血液和本纳米粒跟踪外来体分离为一个新颖的和创新的方法来测量在生物流体外来体的大小和浓度的详细协议。在所提出的实验人外周血用作外来体的来源。然而，其他来源，如尿，痰，细胞培养上清等，也可以被用来作为测试材料。
基于在人类中外来体的浓度的生物变异性，从不同的个体测定可设有外泌体的一个显着变化的浓度。然而，在生物测试探针粒子的浓度可能对结果产生影响。因此，需要一种用于探针的稀释的可靠和标准化的方法。在该方法包含外来体血浆9毫升外周血全血中产生。使用差速离心步骤外来体丸粒从分离1毫升血浆并重新悬浮于5ml蒸馏水以产生悬浮外来体的工作示例。此预先定义的设置为我们提供了颗粒的适宜浓度， 即 NTA在适当的散射强度。旁边的体积和稀释的方面，所使用的溶液的组合物也是重要的。我们已经用蒸馏水进行最后再悬浮外来体。当然，也可以使用不同的介质进行最后稀释步骤，根据所述实验设置的要求。然而，在离子的溶液具有缓冲能力测试样品特别是当ζ电势测量的情况下，谨慎的稀释在紊流自由条件是有用的。对多个样品的直接比较，我们建议保持对所有样品相同的稀释程度。除了敏感性和视频分辨率都设置可以事后通过使用ZetaView分析软件来改变。
<p class="“jove_content”">尽管作者认为，在此介绍了系统目前是最合适的工具，它不是唯一可用的NTA系统。许多以前的报告中已经采用了适用相同的NTA原则，但提供了另一种手段的设计，伴随着一些不同的特点10等系统。我们相信，有关样品处理结果的可重复性和实用性方面是至关重要的选择方法序列切体的评价。我们还认为，理想的检测系统应该消除可能与测量结果干扰用户取决于因素。即这里介绍的外来体分析方法满足了容易处理，以高度的标准。作为另一个优点，在一个快速的过程中进行样品的半自动化分析，产生的结果在很短的时间。外来体的在线可视化辅助分析仪GA在外来体的特性， 比如，总浓度瞬间的想法。一个非常简单的，但优雅除了这里介绍的测量技术是利用抗体标记的外来体和散射激光束通过在检测器的前面使用前的过滤器捕获。以这种方式外来体亚群可根据其表面抗原和其它生物的相关特征是技术上可访问的选择性荧光染色来区分。
我们的粒子跟踪仪器的当前版本的一个缺点是，在非常高的灵敏度水平工件诸如背景噪声可能成为本，这是基于该单元沟道壁。一个技术解决方案，并改善当前系统可能在不久的将来变得可用。通过在通道壁上的激光散射光的这种方法反射将被减少，从而增加了测得的信号和获得的数据和降低检出限的准确性。
尽管当前使用的协议，用于外来体分离是公认的和所施加的粒子跟踪仪具有30nm的下部粒度分布的显着精确的分辨率，但不保证所检测的粒子确实完全正确的外来体。其他颗粒，如死细胞碎片或更大的蛋白质复合物也可以存在于外来体悬浮液，并导致假阳性信号。一个可靠的方法，使这种“污染”可排除可能是电子显微镜（EM），无论是传输EM或扫描EM。不幸的是，没有一般和特殊标记的外来已经确定，到目前为止，虽然有一些先前提出的表面标志已获得了越来越多的关注，其中包括四旋（TSPAN），CD81，C63，CD9 等 11。
“>无论对外来体生物，特别是有关外来体特异性标记研究的未来进展，那就是这里介绍的协议将提供一个强有力的方法用于分离和检测外来体。浓度和尺寸可以很容易地在软件辅助确定直接的方式，该加的选择性荧光标记或荧光团偶联的抗体可能会进一步提高NTA的呈现的方法的可能的应用。Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Referenzen
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
