라이브의 검출<em> 대장균</em> O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

E. 검출 대장균 O157 : ORF Z3276을 사용하여 qPCR에 의해 H7 이 분석의 중요한 요소 중 하나는 qPCR에 사용될 Z3276 프로브의 감도 및 특이성이다. 그것은 E.의 DNA의 게놈의 몇 사본 최저를 감지 할 수 있습니다 대장균 O157 : H7도 1a에 도시 된 바와 같이. 6 개 주요 비 O157 STEC 균주, O104 등의 조사 (120) 비 O157 균주의 표 1과 같이 H4 변종, 살모넬라, 시겔과 긴장, 더 교차 반응은 발견되지 않았다. qPCR에 함께 PMA 처리의 조합 보육 E. 대장균 O157은 : 5 어둠 속에서 최소 2 분 동안 빛에 노출 PMA (50 ㎜)과 H7 세포는 PMA 처리 조건으로 선택했다. 또한, 우리는 PMA 처리 절차를 수정했습니다. 가교 공정에서 사용되는 다양한 투명한 모세관과 비교하여, 96 – 웰 플레이트에 더 효율적인 것으로 밝혀졌다최적의 가교 효과 및 노광 공정 동안 샘플 튜브의 다수 취급하는 것보다 편리 이른다. qPCR에있는 PMA 처리 라이브와 죽은 세포에서 DNA의 증폭 이것의 qPCR 분석에 죽은 세포로부터의 DNA 증폭의 PMA-매개 억제의 효과는 두 개의 직렬 10 배량 라이브 또는 사균 희석 유래 DNA를 사용하여도 1에 나타내었다. 결과는 PMA (적색 곡선)와 및 PMA (파란색 곡선)없이 처리 살아있는 세포에서 생성 된 곡선이 선형과 서로 거의 동일한 것을 보았다. 약간의 CT 값의 차이는 PMA 처리가 qPCR에있는 살아있는 세포의 DNA의 증폭에 거의 영향을 미치지 것을 제안, PMA와 및 PMA (그림 1A)없이 처리 살아있는 세포 사이에 나타내었다. 그러나 15 – CT 값의 차이 (32,000 배)가 PMA를 처리 한 죽은 세포 사이 PMA, 데모없이 표시했다PMA 처리가 효율적으로 죽은 세포 (그림 1B)에서 DNA 증폭을 억제하는 것이 nstrating. qPCR에에 살고 죽은 세포의 혼합물에서 살아있는 세포의 검출 라이브 셀 희석 (8 × 10 0 – 8의 X 10 6 CFU)의 두 가지가 라이브 / 죽은 세포 혼합물로부터 살아있는 세포를 감지하는 PMA 또는 PMA없이 처리 하였다. qPCR의 결과 (그림 2A)는 처리되지 않은 샘플 (파란색 막대)로 처리 살아있는 세포 (보라색 막대)의 숫자에 관련된으로 CT 값의 병렬 역 진보적 인 경향을 보여 주었다. 처리 된 생균은 미처리 생균보다 다소 높은 CT 값을 수득 하였다. CT 값에서 유사 역 누진 경향은도 2b에뿐만 PMA (녹색 막대)로 처리 라이브 / 죽은 세포 혼합물에서 생균의 실수로 관찰되었다. 또한, CT 값이 하향 추세였다106 사균의 존재에도 불​​구하고 이들의 혼합물에서 생균 수가 관찰. 이러한 결과는 죽은 세포로부터 DNA 증폭을 효율적 PMA 처리에 의해 억제되었다 반면 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 CT 값이 단독 생균로부터 DNA를 나타내는 것으로 나타났다. 하지만, PMA로 처리 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 CT 값은 변동 그림 2B (노란색 막대)의 혼합물에서 라이브 세포 수를 반영하는 데 실패했다. 그림 1. 살고 죽은 세포가 PMA 또는 qPCR의 분석에서 PMA없이 처리. (A)의 시리얼 라이브 E. 10 배 희석 대장균 O157 : H7 셀 희석 (8 × 10 0 – 8의 X 10 6 CFU)가 PMA 또는 PMA없이 처리 하였다.CT 값의 qPCR 분석에서 세벌의 평균 CT 값을 나타낸다. (B) Q 비교의 qPCR 분석에서 PMA와 함께 PMA없이 처리 된 생균과 사균의 DNA 증폭의 비교. ΔRn는 강도의 변화, 형광를 의미하는 것은. 더 큰 이미지를 볼하려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2. . PMA-qPCR에 세포 배양의 10 배 희석 (8 × 10 0 – 8의 X 10 6 CFU)의 4 세트로 라이브 / 죽은 세포의 혼합물에서 살아있는 세포의 분화는 표시로 만들어졌다. 제 2 셀 희석 DNA 추출하기 전 또는 치료 동안 세포 희석액 (A) 첫 번째 세트는 PMA로 처리 하였다.(B) 8 × 106 사균 나타낸 바와 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 두 세트를 만들기 위해 세포 희석액의 세 번째와 네 번째 세트로 혼합 하였다. 세포 혼합물의 한 세트는 PMA로 처리하고, 다른 세트는 DNA 추출 전에 PMA없이 처리 하였다. 각 막대는 SD ± 세중 실험의 평균 CT 값을 나타냅니다. 유기체 혈청 형 시험 균주 번호 대장균 2006 시금치 O157 : H7 발생 분리 186 2006 타코 벨 O157 : H7의 분리 58 2006 타코 존 O157 : H7의 분리 11 다른 O157에서 DMB 변형 컬렉션 : H7의 발생 112 O104 : H4 3 O26 18 O103 13 O111 (24) O121 2 Ø45 5 O145 9 O113 2 O91 1 Ø55 9 다른 19 살모넬라 균 균 1 뉴 포트 2 시겔 dysenteriae 6 2 시겔 라 sonnei 알 수없는 2 시겔 flexneri 4 1 시겔 boydii 1 1 합계 481 티수 1. E.의 식별을위한 실시간 PCR 분석에서 유효성 검사에 사용되는 균주 대장균 O157 : H7.