Détection de Live<em> Escherichia coli</em> O157: H7 par les cellules PMA-qPCR

La détection de E. coli O157: H7 par qPCR utilisant ORF Z3276 L'un des facteurs clés de cette analyse est la sensibilité et la spécificité de la sonde Z3276 utilisé dans la qPCR. Il peut détecter aussi peu que quelques copies du génome de l'ADN de E. coli O157: H7 comme représenté sur la Figure 1A. Sur les 120 souches non-O157 examinés, y compris les six grandes souches non-O157 STEC O104: souches, H4, Salmonella et souches de Shigella, aucune réactivité croisée n'a été trouvée, comme indiqué dans le tableau 1. Combinaison du traitement PMA avec qPCR Incubation E. coli O157: H7 des cellules avec PMA (50 mM) pendant 5 minutes à l'obscurité et l'exposition à la lumière pendant 2 min ont été choisies pour des conditions de traitement au PMA. En outre, nous avons modifié PMA procédure de traitement. Par rapport aux différents micro-tubes transparents utilisés dans l'étape de réticulation, une plaque de 96 puits a été trouvé pour être plus efficace d'atteindre l'effet de reticulation optimal et plus pratique que la manipulation d'un grand nombre de tubes d'échantillons au cours du processus d'exposition à la lumière. Amplification de l'ADN à partir de cellules vivantes et mortes PMA-traités dans qPCR Les effets de l'inhibition médiée par le PMA de l'amplification d'ADN à partir de cellules mortes à ce dosage qPCR ont été présentés dans la figure 1 à l'aide d'ADN provenant de deux dilutions de 10 fois de cellules vivantes ou mortes série. Les résultats montrent que les courbes produites par les cellules vivantes traitées avec du PMA (courbe rouge) et sans PMA (courbe bleu) semblent linéaire et presque identique à une autre. Différences de valeurs de CT légères ont été montrées entre les cellules vivantes traitées avec du PMA et sans PMA (Figure 1A), ce qui suggère que le traitement de PMA a peu d'effet sur ​​l'amplification de l'ADN des cellules vivantes dans la qPCR. Mais un 15 – différence de valeur de CT (32000 fois) a été montré entre les cellules mortes traitées avec du PMA et sans PMA, démonstrating que le traitement PMA supprimée efficacement l'amplification d'ADN à partir des cellules mortes (figure 1B). Détection de cellules vivantes à partir de mélanges de cellules vivantes et mortes dans qPCR Deux séries de dilutions de cellules vivantes (8 x 10 0 – 8 x 6 10 UFC) ont été traités avec de la PMA ou sans PMA pour détecter les cellules vivantes de morts mélanges live / cellulaires. Les résultats de qPCR (figure 2A) ont démontré une tendance progressive inverse parallèle de valeurs CT comme liée au nombre de cellules vivantes traitées (barres pourpres) aux échantillons non traités (barres bleues). Les cellules vivantes traitées ont donné des valeurs de CT d'un peu plus élevées que celles de cellules vivantes non traités. Une tendance progressive inverse similaire dans les valeurs CT a été observée avec le nombre réel de cellules vivantes dans les mélanges morts vivants / cellulaires traitées avec de la PMA (barres vertes) ainsi que dans la figure 2B. En outre, cette tendance à la baisse des valeurs de CT étaitobservé avec le nombre de cellules vivantes dans les mélanges en dépit de la présence de 106 cellules mortes. Ces résultats ont montré que les valeurs de CT des mélanges vivants / morts cellulaires représentent l'ADN des cellules vivantes seulement, alors que l'amplification de l'ADN des cellules mortes a été efficacement supprimée par traitement au PMA. Mais, les valeurs de CT de mélanges vivants / morts cellulaires traitées avec du PMA ont fluctué et n'ont pas reflété les nombres de cellules vivantes dans les mélanges de la figure 2B (barres jaunes). Figure 1. Vivent et les cellules mortes traitées avec de la PMA ou sans PMA dans l'essai qPCR. (A) Une série de 10 fois dilué direct E. coli O157: H7 dilutions cellulaires (8 x 10 0 – 8 x 10 6 UFC) ont été traités avec de la PMA ou sans PMA.Les valeurs CT représentent les valeurs CT moyennes des trois exemplaires dans l'essai qPCR. (B) Comparaison de l'amplification d'ADN de cellules vivantes et les cellules mortes traitées avec du PMA et sans PMA dans la comparaison de q essai qPCR. ARn se réfère à la fluorescence changement d'intensité. Cliquez ici pour agrandir l'image. Figure 2. La différenciation des cellules vivantes à partir de mélanges vivants / morts cellulaires par PMA-qPCR Quatre séries de dilutions de 10 fois de cultures de cellules (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU). Ont été effectués comme indiqué. (A) Première série de dilution des cellules a été traitée avec du PMA pendant la deuxième dilution cellulaire était ou non traitée avant l'extraction de l'ADN.(B) 8 x 10 6 cellules mortes ont été mélangés avec les troisième et quatrième séries de dilutions de cellules pour effectuer deux séries de mélanges vivants / morts cellulaires comme indiqué. Une série de mélanges de cellules a été traitée avec du PMA et de l'autre ensemble a été traité sans PMA avant l'extraction de l'ADN. Chaque barre représente les valeurs de CT moyen d'une expérience triple ± SD. Organisme Sérotype Nombre de souches testées E. coli 2006 épinards O157: H7 isolats de 186 2006 Taco Bell O157: H7 isolats 58 2006 Taco John O157: H7 isolats 11 collections de souches de DMB de l'autre O157: H7 112 O104: H4 3 O26 18 O103 13 O111 24 O121 2 O45 5 O145 9 O113 2 O91 1 O55 9 Autre 19 Salmonella Typhi 1 Newport 2 Shigella dysenteriae 6 2 Shigella sonnei Inconnu 2 Shigella flexneri 4 1 Shigella boydii 1 1 Total 481 Tmesure 1. souches utilisées pour la validation de PCR en temps réel pour l'identification de E. coli O157: H7.