检测现场的<em>大肠杆菌</em> O157：H7细胞的PMA-qPCR的

检测大肠杆菌的大肠杆菌 O157：使用ORF Z3276 H7通过qPCR 一个这种测定法的关键因素是在定量PCR中使用的Z3276探针的灵敏度和特异性。它可以检测低至大肠杆菌的DNA的基因组的拷贝数大肠杆菌 O157：H7， 如图1A所示 。检查了120个非O157菌株，包括六个主要非O157 STEC菌株O104的：H4菌株， 沙门氏菌 ， 志贺氏菌和菌株，无交叉反应性，发现，如表1所示。 在PMA处理与定量PCR结合 E.孵化大肠杆菌 O157：H7细胞用PMA（50毫米）5分钟在黑暗中进行曝光2分钟被选定为PMA处理条件。此外，我们修改PMA处理程序。与在交联工序中使用的各种透明微管相比，一个96孔板被发现是更有效的达到最佳的交联效果，并比光曝光过程中处理大量的样品管的更方便。 从PMA处理的活细胞和死细胞的定量PCR DNA扩增从这一定量PCR检测死细胞DNA扩增的PMA介导的抑制效应，采用DNA从两个串行10倍活的或死的细胞稀释液中提取出来， 如图1所示。结果表明，从用PMA（红色曲线）和无PMA（蓝色曲线）处理的活细胞产生的曲线似乎线性和几乎彼此相同。轻微的CT值差异，用PMA和没有PMA（ 图1A）处理的活细胞之间所示，表明PMA处理对活细胞中的定量PCR的DNA扩增的影响不大。但一个15 – CT值差异（32,000倍）与PMA处理的死细胞之间，没有物业管理公司，显示演示nstrating的PMA处理有效地抑制DNA扩增的死细胞（ 图1B）。 从定量PCR活的和死细胞混合物检测活细胞两套活细胞稀释液（8×10 0 – 8×10 6 CFU）与​​PMA或不PMA治疗，检测活细胞的活/死细胞混合物。在定量PCR的结果（ 图2A）表明CT值作为相关处理的活细胞（紫色条），以未处理的样品（蓝色条）的数目的并联逆渐进趋势。处理后的活细胞产生了比未处理的活细胞的一个稍高的CT值。在CT值类似的逆渐进趋势观察到活细胞在用PMA（绿色棒）在图2B中被视为良好的活/死细胞的混合物的实数。此外，CT值的这种下降趋势是尽管106死细胞的存在与活细胞中的混合物的数量变化。这些结果表明，该活/死细胞混合物的CT值表示从单独的活细胞中的DNA，而从死细胞中的DNA扩增效率由PMA处理抑制。但是，用PMA治疗的活/死细胞混合物的CT值波动和没有反映在图2B中的（黄色条）的混合物中的活细胞数。 图1。活细胞和死细胞用PMA或没有在PMA qPCR分析处理（A）的连续10倍稀释E.直播大肠杆菌 O157：H7细胞稀释液（8×10 0 – 8×10 6 CFU）分别用PMA或没有PMA。CT值代表了qPCR实验的一式三份的平均CT值。 （B）用PMA和无PMA在第q比较qPCR分析处理的活细胞和死细胞的DNA扩增的比较。 ΔRn是指荧光强度的变化。 点击这里查看大图。 图2。从由PMA-qPCR的四组的细胞培养物的10倍稀释液（8×10 0 – 8×10 6 CFU）的活/死细胞混合物分化的活细胞所指示而进行。 （ 一 ）第一组细胞稀释液用PMA处理，而第二个单元是稀释或未经处理的DNA提取之前。（B）8×10 6个死细胞与所述第三组和第四组的细胞稀释液，使两套活/死细胞的混合物所指示的。一组的细胞混合物中的溶液用PMA治疗，而另一组是DNA提取之前没有PMA处理。每个条形代表一式三份实验±标准差的平均CT值。 生物 血清型 供试菌株数 大肠杆菌 2006菠菜O157：H7菌株爆发 186 2006 Taco Bell的O157：H7菌株 58 2006年约翰·塔克O157：H7菌株 11 其他0157 DMB应变集合：H7爆发 112 O104：H4 3 O26 18 O103 13 O111 24 O121 2 O45 5 O145 9 O113 2 O91 1 O55 9 其他 19 沙门氏菌 伤寒 1 新港 2 痢疾志贺菌 6 2 宋内志贺氏菌 未知 2 福氏痢疾杆菌 4 1 鲍氏志贺氏菌 1 1 总 481 Ŧ能够1。 用于验证实时PCR检测鉴定大肠杆菌菌株大肠杆菌 O157：H7。