서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우
Summary
V3 워크플로우는 얼룩이 없는 젤을 사용한 웨스턴 블롯 시술입니다. 얼룩없는 기술은 연구원이 단백질 분리 품질을 시각화하고, 전달 효율을 검증하며, 가장 중요한 것은 신뢰할 수있는 적단백질 정량화를 사용하여 관심있는 단백질의 변화를 검증 할 수 있게합니다.
Abstract
서부 얼룩은 매우 유용하고 널리 채택 된 실험실 기술이지만 실행은 어렵습니다. 실험가가 여러 단계의 마지막까지 성공적으로 수행되었는지 알지 못하기 때문에 워크플로는 종종 “블랙 박스”로 특징지어지기도 합니다. 또한 서부 블로팅 공정 전반에 걸쳐 효과적인 품질 관리 도구가 부족하여 서부 얼룩 데이터의 품질이 어려움을 겪을 수 있습니다. 여기서는 기존의 서부 블롯 프로토콜과 관련된 주요 문제를 해결하기 위해 얼룩이 없는 기술을 적용하는 V3 서부 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우를 통해 연구원은 약 20-30분 안에 젤을 실행할 수 있습니다. 2) 젤 실행 후 5 분 이내에 샘플 분리 품질을 시각화하는; 3) 3-10 분에서 단백질을 전송; 4) 정량적으로 전송 효율을 확인하기 위해; 그리고 가장 중요한 것은 5) 총 단백질 로딩 제어를 사용하여 관심 있는 단백질의 수준에 있는 변경을 검증하기 위하여. 이 새로운 접근법은 β 액틴, β 튜룰린, GAPDH 등과 같은 하우스키핑 단백질에 대한 블롯을 제거하고 재보행할 필요성을 제거합니다.
Introduction
서양 얼룩은 매우 유용한 기술9,그러나, 서부 블로팅에 두 가지 주요 문제가있다: 길고 노동 집약적 인 프로세스와 데이터의 품질. 기존 프로토콜에는 약 2일이 필요합니다. 그것은 견본 준비, 젤 주조, 단백질 전기포고 및 전송, 항체 잠복기, 화상 진찰 및 아주 수시로 제거, 보충 및 마지막으로 데이터 분석에 선행된 막 차단을 포함하여 많은 단계를 관련시킵니다. 이 프로세스 전반에 걸쳐 공정 제어를 위한 안정적이고 유연한 도구는 없습니다. 따라서 각 단계에서 오류를 도입할 수 있으며 이러한 오류는 데이터 아티팩트를 생성할 수 있습니다. 따라서 부하 제어는 오류를 식별하고 수정하기 위해 서부 블로팅에서 필수적입니다. 로딩 제어는 일반적으로 각 샘플에서 기준 단백질의 단백질 수준을 확인하여 동등하게 제시되는지 확인함으로써 수행됩니다. 사람들은 종종 β 액틴, β-tubulin, GAPDH와 같은 하우스 키핑 단백질을 로딩 컨트롤로 사용합니다.
웨스턴 블롯 데이터의 품질은 신뢰할 수 있는 로딩 제어에 따라 달라집니다. 그러나 적재 제어를 위해 하우스키핑 단백질을 사용할 때 두 가지 정당한 우려가 있습니다: 1) 하우스키핑 단백질 밴드의 항체 기반 면역 검출은 종종 포화되어 있으며, 따라서샘플(30)의하중 차이를 구별할 수 없다. 2) 가사 단백질 발현 수준은 특정 실험 조건 하에서 샘플에서 다를 수 있으며, 예를 들어 siRNA 치료, 세포 사멸, 세포 분화 등11,28,3,6,10,21. 이러한 우려로 인해 과학 저널은 이제 “정량적 비교, 적절한 시약, 선형 신호 범위를 가진 제어 및 이미징 방법을 사용해야 한다”(Nature guideline)를 요구하고 있습니다. 마찬가지로, 임상 조사의 저널에서 편집자는 더 신뢰할 수있는 로딩 컨트롤을 요구하고있다24. 이러한 이유로, 가사 단백질은 로딩 제어로 사용하기 위해 검증될 필요가 있다. 첫째,면역검출법(14,29)의선형 다이나믹 범위에서 측정되는지 확인해야 한다. 둘째, 모든 샘플26,31,25,19,20에서일관되게 표현되는지 확인해야 한다.
신뢰할 수 있는 적재 제어에 대한 대체 솔루션은 블롯의 총 단백질 측정을 사용하는 것입니다. 일부 연구자들은 쿠마시, 플라밍고 핑크, 시프로 루비, 아미도 블랙, 폰소 S, 얼룩없는 기술과 같은 총 단백질 얼룩으로 얼룩을 얼룩지게하여 각 차선의 총 단백질 신호를 로딩 제어16,20,13,27,1,4,12로측정했습니다. 총 단백질 적재 제어는 가사 단백질과 관련된 함정을 피합니다. 첫째, 각 샘플에 대해 적재된 단백질의 양을 진정한 반영한다. 둘째, 토탈 단백질 얼룩은 서풍 블롯 분석(복합 세포 용액의 10-50 μg 단백질)을 위한 공통 적재 범위에서 우수한 선형 동적 범위를 나타내며,샘플(12)의하중 차이를 정확하게 분화한다.
얼룩없는 기술은 아크릴아미드 젤 용액에 독특한 화합물이 혼합되어 캐스팅 된 젤에 균등하게 분포되는 새로운 토탈 단백질 염색 방법입니다. 전기포고가 완료된 후, 젤은 최소 1분 동안 UV 광에 노출되어 얼룩 화합물이 단백질의 트립토판 잔류물과 반응합니다. 단백질은 UV 빛 하에서 흥분되어 ChemiDoc MP 시스템과 같은 얼룩이없는 사용 된 이미저에서 시각화하고 정량화 할 수있는 강력한 형광 신호를 제공합니다. 그러나 얼룩이 없는 화합물 자체는 자외선을 흡수하지 않아 젤 이미지의 배경이 낮습니다. 트립토판 잔류물의 변형은 돌이킬 수 없으며 단백질은 젤뿐만 아니라 단백질 전달 후 언제든지 얼룩에 시각화 될 수 있습니다.
얼룩없는 기술은 V3 웨스턴 워크플로우(그림 1)에적용되어 전통적인 워크플로우, 특히 가사 단백질을 로딩 컨트롤로 사용하는 것에 대한 우려를 해결합니다. 이 워크플로우를 사용하여, 1) 약 20-30 분에서 젤을 실행, 2) 젤 실행 후 5 분 에서 샘플 무결성 및 단백질 분리 품질을 검사; 3) 3-10 분에서 단백질을 전송; 4) 정량적으로 전송 효율을 확인; 그리고 5) 가장 중요한 것은, 총 단백질 로딩 제어를 사용하여 관심 있는 단백질의 수준에 있는 변경을 검증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전술한 V3 얼룩 없는 프로토콜은 형광 서부 블로팅을 멀티플렉싱하기 위한 것입니다. 또한 화학 발광 검출을 사용하여 서부 블로팅에 적용 될 수 있습니다. 멀티플렉스 형광 웨스턴 블롯 프로토콜에서, 얼룩없는 얼룩 이미지는 두 시간 지점에서 획득됩니다 : 1) 단백질 전달 직후; 2) 항체 배양 후 멀티플렉스 형광 화상 진찰 단계에서. 첫 번째 얼룩 없는 이미지는 전송 효율을 계산하는 데 사용되며 두 번째 얼룩없는 이미지는 로딩 컨트롤로 사용됩니다. 화학 발광 방법이 적용될 때, 화학발광 신호가 얼룩이 없는 채널에도 나타나기 때문에 얼룩이 없고 표적 단백질 신호에 대한 멀티플렉스 영상을 취할 수 없다. 이 경우, 로딩 제어 및 정규화 분석을 위해 단백질 전달 단계 직후에 찍은 얼룩없는 이미지를 사용하는 것이 좋습니다.
V3 웨스턴 워크플로는 하우스키핑 단백질을 로딩 컨트롤로 사용하는 기존의 서부 블롯 워크플로우에 비해 다음과 같은 고유한 이점을 제공합니다.
첫째, V3 워크플로는 관심 있는 단백질 의 수준의 변화를 검증하기 위해 실용적이고 편리하며 보다 신뢰할 수 있는 로딩 제어를 제공합니다. V3 프로토콜은 총 단백질 적재 제어를 사용하여 각 샘플에서 측정된 관심 있는 단백질의 수준을 정규화합니다. 특정 실험 조건하에서 시료 중 포화 면역 검출 및 일관되지 않은 가사 단백질 발현 수준 : 그것은 적재 제어로 하우스 키핑 단백질을 사용하는 두 가지 함정을 피합니다. 가사에 대한 항체로 단계를 제거하고 재로 킹하는 것은 더 이상 필요하지 않습니다. 얼룩이 없는 기술을 사용하여 총 단백질 측정을 위해 쿠마시 또는 시프로 루비와 같은 얼룩으로 얼룩을 더럽히고 얼룩을 내태 필요가 없습니다. Blot 이미지를 획득하는 데 몇 초, 이미지 랩 소프트웨어를 사용하여 총 단백질 정규화를 수행하는 데 약 5분이 걸립니다.
둘째, V3 워크플로우를 통해 과학자들은 절차를 보다 투명하게 만들고 품질 관리를 위한 여러 검사점을 도입하기 때문에 서부 절차를 더 잘 제어할 수 있습니다. 얼룩없는 기술의 도움으로 연구자들은 젤과 얼룩 모두에 단백질 샘플을 시각화 할 수 있습니다. 과학자들은 단백질 샘플 무결성(저하 여부), 분리 품질(침전 여부), 전달 효율 및 전달 품질(심지어 이전 여부)을 평가할 수 있습니다. 이러한 검사점은 연구에서 프로세스의 큰 결함을 볼 때 실험을 종료하고 가난한 샘플및 얼룩에 시간을 낭비하지 않도록 하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 또한 과학자들이 멤브레인 스트리핑 후 상당한 양의 단백질 손실이 있는지 여부와 블롯이 다른 표적 4를재검하는 데 적합한지 여부를 평가하는 데 도움이됩니다.
다음은 V3 서부 워크플로우를 사용하여 좋은 경험과 품질 데이터를 보장하기 위한 몇 가지 팁입니다.
- 젤을 실행 한 직후에 젤을 이미지합니다. 얼룩 화합물을 씻어 버릴 수 있으므로 절차에서 첫 번째 이미징 전에 어떤 버퍼에 젤을 담그지 마십시오.
- 동일한 이미징 영역을 사용하여 프로토콜의 모든 이미지를 수집합니다. 이를 통해 소프트웨어는 총 단백질 정규화와 같은 데이터 분석을 위해 이미지를 오버레이할 수 있습니다.
- 전세 및 전달 후 젤을 이미징할 때 노출 시간을 일관되게 유지합니다. 이렇게 하면 소프트웨어가 전송 효율성을 정량적으로 측정할 수 있습니다.
- 블롯 이미지를 획득할 때 몇 방울의 물이나 TBST로 멤브레인을 적시킵니다. 이것은 표적 단백질 검출을 위한 가능한 더러운 배경 문제를 피할 것입니다.
- 형광성 서부 블로팅을 멀티배싱하기 위해 낮은 형광 PVDF 멤브레인을 사용하십시오.
UV 활성화 후 얼룩이 없는 분자가 돌이킬 수 없는 잔류물을 트립토판 잔류물으로 구속한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 돌이킬 수 없는 변형은 에피토프가 트립토판을 함유하는 경우 단일 클론 항체를 사용할 때 항원 인식에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있다. 다각성 항체는 항원에 다중 전형체를 인식하기 때문에 영향을 받을 가능성이 낮습니다. 불바운드 얼룩없는 분자는 쉽게 젤과 막에서 세척되므로 항체 항원 상호 작용을 방해하지 않습니다.
결론적으로, V3 웨스턴 워크플로우를 통해 서부 블롯 프로세스를 더 빠르고 투명하며 정량적이며 신뢰할 수 있게 합니다. 연구원은 지금 쉽게 그들의 데이터를 더 신뢰할 수 있도록 서쪽 blot 실험에 총 단백질 로딩 제어를 적용할 수 있습니다. V3 얼룩없는 워크플로우는 여러 실험실에서 채택되었으며, 저널은 서부 얼룩22,17,7,8,23,18,15에서로딩 제어로 얼룩없는 데이터를 받아 들인다는 것을 입증했습니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 늑대 디이터 스탈츠 박사, 아르노 레미 박사, 안톤 포쉬 박사, 패트리샤 피아티 박사, 톰 데이비스, 크리스 시모니, 제프 더반 박사에게 이 원고의 비판적 검토와 편집에 감사드립니다. 저자는 또한 기술 지원에 대한 앨리슨 슈워츠에게 감사드립니다.
Materials
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |
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