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Immunologie und Infektion

In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50823
, , ,
1Department of Pediatrics,Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology,MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital

Summary

La migration trans-épithéliale de neutrophile en réponse à l’infection bactérienne muqueuse contribue aux dommages épithéliaux et à la maladie clinique. Un modèle in vitro a été développé qui combine l’agent pathogène, les neutrophiles humains, et les couches humaines polarisées de cellules épithéliales cultivées sur des filtres de transwell pour faciliter des investigations vers démêler les mécanismes moléculaires orchestrant ce phénomène.

Abstract

Les surfaces muqueuses servent de barrières protectrices contre les organismes pathogènes. Les réponses immunitaires innées sont activées lors de la détection de l’agent pathogène conduisant à l’infiltration de tissus avec des cellules inflammatoires migratrices, principalement des neutrophiles. Ce processus a le potentiel d’être destructeur pour les tissus s’il est excessif ou maintenu dans un état non résolu.  Des modèles in vitro cocultured peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires uniques impliqués dans la migration trans-épithéliale induite par l’agent pathogène de neutrophile. Ce type de modèle offre une polyvalence dans la conception expérimentale avec possibilité de manipulation contrôlée de l’agent pathogène, de la barrière épithéliale ou des neutrophiles. L’infection pathogène de la surface apicale des monocouches épithéliales polarisées cultivées sur des filtres perméables de transwell incite basolateral physiologiquement approprié à la migration trans-épithéliale apicale des neutrophiles appliquées à la surface basolateral. Le modèle in vitro décrit ici démontre les étapes multiples nécessaires pour démontrer la migration de neutrophile à travers une monocouche épithéliale polarisée de poumon qui a été infectée par le pathogène P. aeruginosa (PAO1). L’ensemencement et la culture des transwells perméables avec les cellules épithéliales dérivées humaines de poumon est décrit, avec l’isolement des neutrophiles du sang humain total et la culture de PAO1 et de K12 E. coli non pathogène (MC1000).  Le processus émigrationnel et l’analyse quantitative des neutrophiles migrés avec succès qui ont été mobilisés en réponse à l’infection pathogène sont montrés avec des données représentatives, y compris des contrôles positifs et négatifs. Ce système de modèle in vitro peut être manipulé et appliqué à d’autres surfaces muqueuses. Les réponses inflammatoires qui impliquent l’infiltration excessive de neutrophile peuvent être destructives aux tissus de centre serveur et peuvent se produire en l’absence des infections pathogènes. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui favorisent la migration transépithéliale des neutrophiles par la manipulation expérimentale du système d’analyse de coculture in vitro décrit ici a un potentiel significatif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une gamme de maladies infectieuses et inflammatoires muqueuses.

Introduction

Les surfaces muqueuses servent de barrières physiques et immunologiques offrant une protection contre les menaces externes omniprésentes dans l’environnement1,2. Cette barrière épithéliale protectrice peut être compromise lorsque des organismes pathogènes envahissent2. Dans le cas d’un agent pathogène bactérien, cette rencontre provoque souvent un processus inflammatoire en activant le système immunitaire inné et en déclenchant une mobilisation rapide des granulocytes premiers répondants appelés neutrophiles2-4. Les agents chimiotactiques facilitant le recrutement des neutrophiles sont produits en partie par les cellules épithéliales muqueuses cherchant à débarrasser l’hôte de l’agent pathogène incriminé2-4. Infiltration excessive ou non résolue de neutrophiles de la surface épithéliale muqueuse peut provoquer une pathologie importante1,5. Il s’agit d’une conséquence des lésions tissulaires non spécifiques causées par l’arsenal neutrophile antibactérien5-7. Dans de tels cas, la capacité bactérienne de clairance des neutrophiles est éclipsée par la destruction du tissu de centre serveur pendant une insulte infectieuse.  La perturbation de la fonction protectrice de la barrière épithéliale peut entraîner une exposition accrue des tissus sous-jacents à des micro-organismes et/ou à des toxines, exacerbant davantage la pathologie de la maladie8,9. Ces conséquences peuvent être observées dans plusieurs systèmes d’organes, y compris le poumon et le tube digestif1,5. En outre, les conditions inflammatoires non infectieuses telles que les épisodes sévères d’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) sont marquées par la rupture pathologique de la barrière épithéliale muqueuse par une réponse neutrophile excessive4,5,10-12.

Le processus complexe de recrutement des neutrophiles suivant une infection muqueuse implique plusieurs étapes compartimentées1,5,13,14. Tout d’abord, les neutrophiles doivent s’écarter de la circulation via une série d’interactions de cellule à cellule qui facilitent la migration trans-endothéliale1,13. Les neutrophiles naviguent ensuite dans l’espace interstitiel existant contenant la matrice extracellulaire1,14. Pour atteindre la lumière de la muqueuse infectée, les neutrophiles doivent alors migrer à travers la barrière épithéliale1,4,5. Ce phénomène complexe en plusieurs étapes est souvent étudié dans son ensemble à l’aide de modèles animaux in vivo d’infection15. De tels modèles sont utiles pour établir la nécessité de facteurs spécifiques, tels que les chimiokines, les molécules d’adhésion ou les voies de signalisation qui participent au processus global, mais sont largement inadéquats pour résoudre les contributions moléculaires critiques pour chaque étape compartimentée distincte16. Les systèmes in vitro coculturels modélisant la migration trans-endothéliale, trans-matricielle ou trans-épithéliale des neutrophiles ont été particulièrement utiles à cet égard1,14,16,17.

Un système robuste de dosage de coculture a été développé dans le but de déchiffrer les mécanismes responsables de la migration transépithéliale des neutrophiles en réponse à l’infection pathogène18-22. Ce modèle consiste à infecter la surface apicale des couches de cellules épithéliales humaines polarisées avec un agent pathogène bactérien suivie de l’application de neutrophiles humains fraîchement isolés sur la surface basolatérale18-22. Les neutrophiles migrent à travers la barrière épithéliale en réponse aux produits chimiotactiques épithéliaux-dérivés sécrétés après l’infection pathogène18,21-23. Ce système modèle a été utilisé en utilisant des cultures épithéliales intestinales et pulmonaires exposées à des agents pathogènes bactériens spécifiques aux tissus appropriés et a dévoilé de nouveaux mécanismes moléculaires probablement importants pour le processus de recrutement des neutrophiles lors de l’infection muqueuse3,8,19,24-28. La force de ce modèle de coculture in vitro est qu’une approche réductionniste permet au chercheur de manipuler expérimentalement l’agent pathogène, la barrière épithéliale et/ou le neutrophile dans un système bien contrôlé, hautement reproductible et assez peu coûteux. Les informations recueillies à partir de cette approche peuvent être efficacement exploitées pour effectuer une analyse ciblée des événements compartimentés lors du recrutement des neutrophiles à l’aide de modèles d’infection in vivo 22,29,30.

Cet article démontre les étapes multiples nécessaires pour que l’établissement réussi de ce modèle reproductible explore la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène. Des barrières épithéliales de poumon infectées avec l’agent pathogène Pseudomonas aeruginosa sont présentées dans cet article ; cependant, d’autres épithéliums tissulaires et agents pathogènes peuvent être substitués avec des modifications mineures. L’ensemencement et la culture des couches polarisées de cellules épithéliales de poumon sur les filtres perméables enrobés de collagène inversés sont détaillés ci-dessous, de même que la croissance de l’aeruginosa pathogène de P. et l’isolement des neutrophiles du sang total. Comment ces composants sont combinés pour observer la migration trans-épithéliale induite par le microbe pathogène de neutrophile est présentée avec les contrôles positifs et négatifs appropriés pour établir une analyse reproductible. La polyvalence de cette approche pour examiner de divers aspects de la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène est discutée concernant des études spécifiques dans la littérature.

Protocol

Les étapes (1-3) doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. 1. Transwells de revêtement de collagène Faire une solution de collagène à 30 μg/ml. Diluer 3 mg/ml de collagène stock 1:100 dans de l’éthanol à 60 % qui a été passé à travers une unité filtrante de 0,2 μm. Vortex dilué 30 μg/ml solution. Remarque: Il n’est pas nécessaire de vortex la solution mère de collagène à 3 mg / ml, car cette…

Representative Results

Plusieurs études ont démontré que les couches épithéliales infectées par des agents pathogènes facilitent la migration transépithéliale des neutrophiles3,8,19,24-28,31,32. Ceci se produit par l’intermédiaire d’une induction pathogène-spécifique d’un gradient chimiotactique cellule-dérivé de cellules épithéliales de neutrophile3,23. Par exemple, P. aeruginosa pathogène interagissant avec la surface apicale des cellules épithéliales pulmonaires provoque la migration d…

Discussion

La migration des neutrophiles à travers les surfaces épithéliales muqueuses est une caractéristique commune dans la pathologie de la maladie après une infection par des agents pathogènes bactériens3. La méthodologie décrite ici offre une approche rapide et simple pour isoler expérimentalement cet événement discret en utilisant un système d’analyse de coculture in vitro dérivé de cellules humaines qui modélise une caractéristique du processus inflammatoire déclenché par des infecti…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus financièrement par les NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich  C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich  S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich  D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich  213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich  S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich  ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich  H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich  H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich  SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich  A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich  H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich  F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789
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Referenzen

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Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).
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