Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili
Summary
Mukozal bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak nötrofil trans-epitel göçü epitel yaralanmasına ve klinik hastalığa katkıda bulunur. Bu fenomeni düzenleyen moleküler mekanizmaların çözülmesine yönelik araştırmaları kolaylaştırmak için transwell filtrelerinde yetişen patojen, insan nötrofilleri ve polarize insan epitel hücre katmanlarını birleştiren bir in vitro model geliştirilmiştir.
Abstract
Mukozal yüzeyler patojenik organizmalara karşı koruyucu bariyerler görevi eder. Doğuştan gelen immün yanıtlar, başta nötrofiller olmak üzere göç eden enflamatuar hücrelere sahip dokuların sızmasına yol açan patojeni algılayarak aktive edilir. Bu süreç aşırı veya çözülmemiş durumda tutulursa dokulara zarar verme potansiyeline sahiptir. Kokültüre in vitro modeller patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünde rol oynayan benzersiz moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu tür bir model, patojenin, epitel bariyerinin veya nötrofilin kontrollü manipülasyonu için fırsat ile deneysel tasarımda çok yönlülük sağlar. Geçirgen transwell filtrelerinde yetişen polarize epitel monolayerlerin apikal yüzeyinin patojenik enfeksiyonu, bazolateral yüzeye uygulanan nötrofillerin apikal trans-epitel göçüne fizyolojik olarak ilgili bazolateral instiakte eder. Burada açıklanan in vitro model, patojenik P. aeruginosa (PAO1) ile enfekte olmuş polarize bir akciğer epitel monolayerinde nötrofil göçünü göstermek için gerekli olan birden fazla adımı göstermektedir. geçirgen transwelllerin insan türevi akciğer epitel hücreleri ile tohumlandırılması ve kült örülmesi, nötrofillerin tüm insan kanından izolesi ve PAO1 ve nonpathojenik K12 E. coli ‘nin (MC1000) kültürü ile birlikte tanımlanmıştır. Patojenik enfeksiyona yanıt olarak harekete geçirilen başarılı göç etmiş nötrofillerin göç süreci ve nicel analizi, pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere temsili verilerle gösterilmiştir. Bu in vitro model sistemi manipüle edilebilir ve diğer mukozal yüzeylere uygulanabilir. Aşırı nötrofil infiltrasyonunu içeren enflamatuar yanıtlar konak dokular için yıkıcı olabilir ve patojenik enfeksiyonların yokluğunda ortaya çıkabilir. Burada açıklanan in vitro kokültür tahlil sisteminin deneysel manipülasyonu yoluyla nötrofil trans-epitel göçünü teşvik eden moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması, bir dizi mukozal enfeksiyöz ve enflamatuar hastalık için yeni terapötik hedefleri belirlemek için önemli bir potansiyele sahiptir.
Introduction
Mukozal yüzeyler, çevreye nüfuz eden dış tehditlere karşı koruma sağlayan fiziksel ve immünolojik bariyerler görevi görer1,2. Patojenik organizmalar istila ettiğinde bu koruyucu epitel bariyeri tehlikeye atılabilir2. Bakteriyel bir patojen durumunda, bu karşılaşma genellikle doğuştan gelen bağışıklık sistemini aktive ederek ve nötrofiller2-4olarak bilinen ilk müdahale granülositlerinin hızlı bir şekilde harekete geçirilmesine neden olarak enflamatuar bir süreci tetikler. Nötrofil alımını kolaylaştıran kemotaktik ajanlar kısmen, konukcu patojen2-4’tenkurtulmak isteyen mukozal epitel hücreleri tarafından üretilir. Mukozal epitel yüzeyinin aşırı veya çözülmemiş nötrofil infiltonu önemli patolojiye neden olabilir1,5. Bu, anti-bakteriyel nötrofil cephaneliğinin neden olduğu spesifik olmayan doku hasarının bir sonucudur5-7. Bu gibi durumlarda, nötrofillerin bakteriyel boşluk kapasitesi, bulaşıcı bir hakaret sırasında konak dokusunun tahrip edilmesiyle gölgelenmiştir. Koruyucu epitel bariyer fonksiyonunun bozulması, alttaki dokunun mikroorganizmalara ve/veya toksinlere daha fazla maruz kalmasına yol açarak hastalık patolojisini daha da kötüleştirebilir8,9. Bu sonuçlar akciğer ve sindirim sistemi de dahil olmak üzere birden fazla organ sisteminde görülebilir1,5. Ayrıca, şiddetli astım nöbetleri, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ve inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi noninferektif inflamatuar durumlar, mukozal epitel bariyerinin patolojik ihlali ile aşırı nötrofik yanıt4,5,10-12ile işaretlenmiştir.
Mukozal enfeksiyonu takiben nötrofil işe alımının karmaşık süreci, birkaç bölümlere ayrılmış adım1,5,13,14içerir. İlk olarak, nötrofiller trans-endotel göçini kolaylaştıran bir dizi hücreden hücreye etkileşim yoluyla dolaşımdan kalkmalıdır1,13. Nötrofiller daha sonra hücre dışı matris1,14içeren mevcut geçiş boşluğunda gezinir. Enfekte mukozanın lümenine ulaşmak için, nötrofillerin daha sonra epitel bariyeri1,4,5boyunca göç etmesi gerekir. Bu karmaşık multistep fenomeni genellikle enfeksiyonun in vivo hayvan modelleri kullanılarak agregada araştırılır15. Bu tür modeller, kemokinler, yapışma molekülleri veya genel sürece katılan ancak her ayrı bölümlere ayrılmış adım16için kritik olan moleküler katkıları çözmek için büyük ölçüde yetersiz olan sinyal yolları gibi belirli faktörlerin gerekliliğini belirlemek için yararlıdır. Nötrofillerin trans-endotel, trans-matris veya trans-epitel göçünü modelleyen kokültüre in vitro sistemler bu konuda özellikle yararlı olmuştur1,14,16,17.
Patojenik enfeksiyon18-22’yeyanıt olarak nötrofil trans-epitel göçünden sorumlu mekanizmaların deşifre edilmesi amacıyla sağlam bir kokültür tahlil sistemi geliştirilmiştir. Bu model, polarize insan epitel hücre katmanlarının apikal yüzeyini bakteriyel bir patojenle enfekte etmeyi ve ardından yeni izole edilmiş insan nötrofillerinin bazolateral yüzeye uygulanmasını içerir18-22. Nötrofiller, patojenik enfeksiyon18,21-23’ünardından salgılanan epitel türevi kemotektik ürünlere yanıt olarak epitel bariyeri boyunca göç eder. Bu model sistemi, uygun doku spesifik bakteriyel patojenlere maruz kalan bağırsak ve akciğer epitel kültürleri kullanılarak kullanılmıştır ve mukozal enfeksiyon sırasında nötrofil işe alım süreci için önemli olan yeni moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmıştır3,8,19,24-28. Bu in vitro kokültür modelinin gücü, indirgemeci bir yaklaşımın araştırmacının iyi kontrol edilen, oldukça tekrarlanabilir, oldukça ucuz bir sistemde patojeni, epitel bariyerini ve/ veya nötrofili deneysel olarak manipüle etmesini sağlar. Bu yaklaşımdan toplanan içgörü, in vivo enfeksiyon modelleri22,29,30kullanarak nötrofil alımı sırasında bölümlere ayrılmış olayların odaklanmış analizini yapmak için etkili bir şekilde kullanılabilir.
Bu makalede, patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçini keşfetmek için bu tekrarlanabilir modelin başarılı bir şekilde kurulması için gerekli birden fazla adım göstermektedir. Pseudomonas aeruginosa patojeni ile enfekte olan akciğer epitel bariyerleri bu makalede yer almaktadır; bununla birlikte, diğer doku epitelleri ve patojenleri küçük değişikliklerle değiştirilebilir. Ters kollajen kaplı geçirgen transwell filtrelerinde polarize akciğer epitel hücre katmanlarının tohumlaması ve kültleştirilmesi, patojenik P. aeruginosa’nın büyümesi ve nötrofillerin tam kandan izolasyonu gibi burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu bileşenlerin patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünü gözlemlemek için nasıl birleştirildiği, tekrarlanabilir bir test oluşturmak için uygun pozitif ve negatif kontrollerle birlikte sunulmaktadır. Patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünün çeşitli yönlerini incelemek için bu yaklaşımın çok yönlülüğü literatürdeki belirli çalışmalara atıfta bulunularak tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mukozal epitel yüzeylerde nötrofil göçü bakteriyel patojenlerle enfeksiyonu takiben hastalık patolojisinde yaygın bir özelliktir3. Burada açıklanan metodoloji, bakteriyel enfeksiyonların tetiklediği enflamatuar sürecin bir özelliğini modelleyen bir insan hücresi türetilmiş in vitro kokültür tahlil sistemini kullanarak bu ayrık olayı deneysel olarak izole etmek için hızlı ve basit bir yaklaşım sunmaktadır. Bu sistem başlangıçta Salmonella typhimurium, Shigell…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH (1 R01 AI095338-01A1) tarafından finansal olarak desteklendi.
Materials
| NCl-H292 cells | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) liquid | Invitrogen | 14190-144 | without calcium and magnesium |
| Heat Inactivated Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-147 | 10% added to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC. Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term. |
| Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterile, without calcium and magnesium |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Stock = 0.4% |
| Collagen, Rat Tail | Invitrogen | A10483-01 | Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Component of 1 M citrate buffer |
| Dextrose anhydrous | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Component of acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Ammonium Chloride | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| HBSS(+) powder | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Key component of HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Component of HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Follow vendor instructions to coat glass pipette tips |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Key component of ABTS substrate solution |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Component of ABTS substrate solution |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC. |
| Gelatin Type B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Optional, can improve neutrophil purity |
| Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well migration plate | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-well wash plate | Falcon | 35-1147 | Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse |
| 96-well plate | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm |
| Petri dish | Falcon | 35-1013 | Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells. |
| 500 ml 0.2 μm filter / flask | Fisher Scientific | 09-740-25A | To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution |
| 5-3/4 in glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | Coat tips with Sigmacote prior to use |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Curved, Serrated |
| Invertoskop Inverted Microscope | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Microplate Reader | Molecular Devices | #432789 |
Referenzen
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
- McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
- Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil’s role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
- Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
- Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
- Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
- Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
- Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
- Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
- McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
- McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
- Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
- Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
- McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
- Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
- Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
- Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
- McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
- Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
- Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
- Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
- Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
- Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
- Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
- Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
- Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
- Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
- Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
- Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
- Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
- Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).
