Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell'ippocampo
Summary
Precipitazione di fosfato di calcio è un metodo conveniente ed economico per la trasfezione di cellule in coltura. Con ottimizzazione, è possibile usare questo metodo su cellule di difficile trasfezione come neuroni primari. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni dell'ippocampo co-coltivate con le cellule astrogliali.
Abstract
Precipitazione di fosfato di calcio è un metodo conveniente ed economico per la trasfezione di cellule in coltura. Con ottimizzazione, è possibile usare questo metodo su cellule di difficile trasfezione come neuroni primari. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni dell'ippocampo co-coltivate con le cellule astrogliali.
Introduction
Neuroni primari sono uno dei tipi di cellule più difficili da trasfettare come sono postmitotico e sono molto sensibili alle variazioni microambientali. Ci sono quattro tipi comunemente usati di metodi per l'espressione di geni esogeni e RNA breve tornante (shRNAs) in queste cellule 1. Ognuno ha i suoi vantaggi e svantaggi. Ad esempio, elettroporazione viene di solito effettuata su neuroni appena isolate 2, come le cellule devono essere trasferiti in cuvette per trasfezione. Infezione da virus di solito può raggiungere un grado elevato di efficienza 3, ma è sempre rischiosa per gli operatori-intensità di lavoro. Molti reagenti di transfezione lipidi mediata sono disponibili in commercio, con vari gradi di successo nei neuroni e diversi livelli di citotossicità.
Fosfato di calcio trasfezione rappresenta un metodo conveniente ed economico per l'introduzione di geni estranei in neuroni. Il metodo è stato usato per la prima a introdurre adenovirus DNA in cel mammiferiLS di Graham e Van Der Eb (1973) 4. La trasfezione è stata eseguita miscelando cloruro di calcio con il DNA ricombinante in un tampone fosfato. Questo permette la formazione di fosfato di DNA / calcio precipitati che, quando gradualmente lasciato cadere su un monostrato di cellule, aderire alla superficie cellulare, sono assorbite per endocitosi e finalmente entrare nel nucleo 5. Questo processo porterebbe alla espressione di geni estranei introdotti nella cellula bersaglio. Tipiche efficienze di fosfato di calcio serie trasfezione tra il 0.5-5% 6-8. Tuttavia, con un'attenta ottimizzazione e coerente attuazione del protocollo sperimentale, è possibile raggiungere una efficienza di trasfezione di quasi il 50%. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni primari, che sono co-coltivate con le cellule astrogliali in un formato panino 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi parametri chiave che devono essere attentamente controllata per trasfezioni costantemente successo 10,11. Il parametro più critico per il fosfato di calcio trasfezione è il valore di pH 2x HBS, che nelle nostre mani solito varia tra 7,10-7,15. Si consiglia di fare tre lotti di titoli con valori di pH in 0.05 incrementi per spiegare la differenza tra pH-metri. In alternativa, il kit di transfezione mammiferi Clontech fornisce 2x HBS che produce costantemente buona efficienza. Tenere presente …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal NIH concedere NS065183 e fondi di start-up della Facoltà di Medicina di Rutgers Robert Wood Johnson.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
Referenzen
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
