차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질
Summary
인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
차 뉴런들이 postmitotic이며 마이크로 환경 변화에 매우 민감하다 같이 트랜 어려운 세포 유형의 하나이다. 이러한 세포 1 외인성 유전자와 짧은 헤어핀 RNA를 (shRNAs)의 표현 방법의 네 가지 일반적으로 사용되는 유형이있다. 각각은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 세포 형질 감염을위한 큐벳에 전송해야 예를 들어, 전기 천공은 일반적 갓 절연 뉴런이 수행된다. 바이러스 감염은 일반적으로 매우 높은 효율 3를 달성하지만, 더 노동 집약적 인 운영과 위험하다 할 수 있습니다. 많은 지질 매개 형질 전환 시약은 신경 세포와 세포 독성의 다른 수준에있는 성공의 학위를 변화와 함께, 상업적으로 이용 가능하다.
인산 칼슘 형질 감염은 뉴런에 외래 유전자를 도입하기위한 편리하고 경제적 인 방법을 나타낸다. 첫번째 방법은 포유 동물 CEL에 아데노 바이러스 DNA를 도입하기 위해 사용 하였다그레이엄과 반 데르 EB를 (1973)에 의해 LS 4. 형질 포스페이트 완충액에서의 재조합 DNA와 염화 칼슘을 혼합함으로써 수행되었다. 이것은 서서히 세포 단층 상에 떨어질 때 DNA / 칼슘 포스페이트의 형성은 세포 표면에 부착, 엔도 사이토 시스에 의해 다루어 최종적 핵 5를 입력되며, 이는 석출물 허용한다. 이 과정은 표적 세포에 도입 된 외래 유전자의 발현을 초래할 것이다. 0.5-5 % 6-8 사이 인산 칼슘 형질 범위의 전형적인 효율성. 그러나, 조심 최적화 실험 프로토콜의 일관된 실행을, 거의 50 %의 형질 감염 효율에 도달 할 수있다. 여기에서 우리는 샌드위치 형식 9 astroglial 세포와 공 배양하는 기본 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
주의 깊게 지속적으로 성공적인 형질 (10, 11)에 대해 제어 할 필요가 몇 가지 주요 매개 변수가 있습니다. 칼슘 포스페이트 형질 감염에 대한 가장 중요한 매개 변수는 우리 손에 보통 7.10-7.15 사이에서 변화 2X HBS의 pH 값이다. 우리는 산도 미터 사이의 차이를 설명 할 수는 0.05 단위로 pH 값과 주식의 세 가지 배치를하는 것이 좋습니다. 또한, 클론 테크 포유류의 형질 전환 키트는 지속적으로…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 그랜트 NS065183 및 러트 거스 로버트 우드 존슨 의과 대학에서 창업 자금을 지원합니다.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
Referenzen
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