Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen
Summary
Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.
Abstract
Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.
Introduction
Primaire neuronen zijn een van de moeilijkste celtypen te transfecteren ze postmitotic en zijn zeer gevoelig voor micro-omgevingsveranderingen. Er zijn vier courante methoden voor expressie van exogene genen en korte haarspeld RNA (shRNAs) in deze cellen 1. Elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Zo wordt elektroporatie meestal uitgevoerd op vers geïsoleerde neuronen 2, zoals cellen in cuvetten voor transfectie moet worden overgedragen. Virusinfectie kan bereiken doorgaans zeer hoog rendement 3, maar is meer arbeidsintensief en riskant voor de exploitanten. Veel lipide gemedieerde transfectie reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, met wisselend succes in neuronen en verschillende niveaus van cytotoxiciteit.
Calciumfosfaattransfectie is een gemakkelijke en economische methode voor het introduceren van vreemde genen in neuronen. De werkwijze werd eerst gebruikt om adenovirus DNA in zoogdierlijke cells door Graham en Van der Eb (1973) 4. Transfectie werd uitgevoerd door mengen van calciumchloride met recombinant DNA in een fosfaatbuffer. Dit maakt de vorming van DNA / calciumfosfaat precipitaten die bij geleidelijk vallen op een monolaag van cellen hechten aan het celoppervlak worden door endocytose taken en voert uiteindelijk de kern 5. Dit proces leidt tot de expressie van geïntroduceerde vreemde genen in de doelcel. Typische rendementen van calciumfosfaattransfectie bereik tussen 0,5-5% 6-8. Echter, met een zorgvuldige optimalisatie en consistente uitvoering van het experimentele protocol, is het mogelijk om een transfectie-efficiëntie van bijna 50% bereikt. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaat transfectie van primaire hippocampale neuronen, die worden gekweekt samen met astrogliale cellen in een sandwich formaat 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke parameters die moeten zorgvuldig worden gecontroleerd voor consistent succesvol transfecties 10,11. De meest kritische parameter voor calciumfosfaat transfectie is de pH van 2x HBS, die in onze handen varieert meestal tussen 7,10-7,15. Wij raden het maken van drie partijen van de voorraden met pH-waarden in stappen van 0,05 om rekening te houden met het verschil tussen de pH-meter. Als alternatief, de Clontech zoogdieren transfectiekit biedt 2x HBS die consequent levert goede ef…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie NS065183 en start-up fondsen van de Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
Referenzen
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
