인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

시작하기 전에주의 사항 : 인간의 태아 pancreata은 출생 결함 연구소, 조직을 수확 워싱턴 대학 (시애틀, 워싱턴, USA)에서 얻을 수 있었다. 샘플 조직 기증, 저장 및 사용에 대한 동의는 센터에서 기증자로부터 얻은 것입니다. 프로토콜의 동의 문을 서면으로 제공하고 캘리포니아 대학 샌디에이고, 인간의 연구 울타리 프로그램은 전체 연구 (프로토콜 # 081237XT)을 승인했다. 그것은 인간 태아 췌장 전체 절차 동안 얼음에 췌장 채 컨테이너 모두를 유지하는 것이 필수적이다. 해리와 소화 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 인간의 태아 췌장 저장 및 췌장의 전송을위한 버퍼로부터 얻은 병원을 보냅니다. (RPMI-1640 + 10 % 보통 사람의 혈청 (NHS), 300 MM의 트레할로스 SG, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 fungizone). 인간의 태아 췌장의 1. 해부 2.5 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 수득 HBSS에서 RT 콜라게나 XI 5 ㎎을 녹인다. 4 ℃에서 살균 (멸균) 섬광 유리 병 및 저장소에 0.22 미크론 주사기 필터 솔루션을 살균 필터 조직 문화 후드에서 2 멸균 페트리 접시, 멸균 작은 도가니 (도가니를 사용할 수없는 경우, 작은 비커가 치환 될 수있다), 멸균 가위와 집게를 설정합니다. 췌장을 세척 한 배양 접시에 2 ㎖ HBSS를 추가합니다. 약 1 ㎖를 떠나 태아의 췌장을 포함하는 관에서 대기음 액체. HBSS없이 60mm 페트리 접시에 집게로 췌장을 제거합니다. 이 실험을 위해, 태아 ICCS는 9~23주까지 임신 주수와 신선한 pancreata에서 생성됩니다. 이전 gestionational 연령별 pancreata로부터 격리 인해 췌장의 크기로 어렵다. 프로토콜 23 주 P는 그러나 인수 이후 임신 주수에 적용 가능할ancreata이 시간 이후에 있기 때문에 연방 (미국) 제한으로 어렵습니다. 때때로, 태아의 췌장 비장, 지방, 또는 원래의 해부에서 연결된 결합 조직에 도착합니다. 여분의 조직을 육안으로 쉽게 볼 수 있고 프로토콜을 시작하기 전에 췌장에서 제거되어야한다. 페트리 접시에 차가운 HBSS (~ 0.5 ㎖)의 최소 볼륨에서 췌장을 씻어. 얼음 양동이에 멸균 핀셋과 장소를 사용하여 작은 멸균 도가니로 청소 췌장 이동합니다. 50 ML의 원심 분리기 튜브의 홀더에 도가니를 배치하고, 가위 2 쌍을 사용하여, 적극적으로 몇 분 동안 췌장 슬라이스. (일반적으로 2 ~ 5 분간 만 시간은 조직의 크기와 견고성에 달려있다). 기술을 절단하는 것이 중요합니다. 단지 대향 핸들을 이동 고정 위치가 위의 한 쪽을 잡아. 위의 조건에 도가니의 바닥에 휴식한다. 작은으로 췌장을 깰 빠른 가위 운동을 계속조각. 조직 조각이 작을수록 콜라게나가 작동 할 것이다. 최대 10 분 동안 200 rpm에서 37 ° C에 물 목욕 셰이커 세트의 콜라게나과 장소를 포함하는 유리 병에 HBSS는 + 다진 췌장의 1.5 ML을 추가합니다. 처음 5 분 동안 더 자주 번 이상 확인하지 않습니다. 소화 시간이 조직의 품질에 따라, 적은 6과 같은 분은 충분하다. 입자가 작고 균일 때 종점이다. 콜라게나 제 활성을 중지 차가운 HBSS와 유리 병 (15 ㎖)를 입력합니다. 얼음에 넣고 덩어리가 10 분 동안 정착 할 수 있습니다. 종종이 시점에서, 일부 세포의 죽음이 발생하고 DNA는 미디어에 배포됩니다. 이 매체 '힘줄'할 수있다; 이 경우, 용액에 100 μL의 DNA 분해 효소 (10 밀리그램 / 밀리리터)를 추가한다. 섬광 유리 병의 조직 (7-8 ㎖)에 약간의 절반 이하 전체를 떠나는 최상층시 10 분, 대기음에 정착 한 후. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다5 ㎖의 HBSS를 추가합니다. 300 X g에서 5 분 원심 분리기. HBSS를 기음과 RPMI-1640 루타, 10 % 보통 사람의 혈청 (NHS), 10 mM의 HEPES 산도 7.2, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 fungizone을 포함하는 5 ㎖ 미디어 세포를 재현 탁. 60mm 페트리 접시를 접시. β 세포를 생성하는 것을 시도 연구원, 언론에 HGF를 (10 NG / ML 최종)를 추가합니다. 또한, 그룹의 개수는 인크 레틴 호르몬 GLP-1과 배지를 보충하는 것도 β 세포 28을 증가 시킨다는 것을 증명하고있다. 세포는 ICCS를 집계하고 형성하는 72 시간 동안 정지로 유지되어야합니다. 현탁액을 72 시간 후, 세포는 앞서 설명한 바와 같이 29 인간 세포주 HTB9 행렬의 행렬에 도금 될 수있다. 에 관계없이 성장 조건의 미디어마다 48 시간을 변경해야합니다. 서스펜션 성장 ICCS에있는 내분비 세포의 증식과 성숙의 마커의 2. 면역 형광, 단층, 또는 유리 Coverslips는에 세포 증식을 측정하기 위해, 현탁액에 부착 세포 또는 세포의 하나의 BrdU 라벨링 전에 PFA 고정 내지 12 시간 동안 수행된다. BrdU의 시약을 희석 1:100 및 RPMI-1640 살균 필터, 루타, 10 % NHS, 10 mM의 HEPES 산도 7.0, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 fungizone. 정지 세포의 경우 : 300 XG와 대기음 배양 배지에서 5 분 동안 원심 분리기. 300 XG와 대기음에서 5 분 동안 원심 분리기를 ICCS을 씻어 10 ML PBS를 추가합니다. ICCS 파라핀에 포함 할 예정이라면, 선택 의정서 3.1-3.17를 따르십시오 자기편 세포를 들면 다음과 같습니다. 배지를 제거하고 상기 한 바와 같이 PBS로 세포를 씻어. 다음 PBS로 두 번 세척, 실온에서 4 % PFA로 20 분 동안 세포를 고정합니다. 이 시점에서, 플레이트는 파라 필름으로 포장 될 수 있으며, 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 PBS에 저장됩니다. 실온에서 10 분 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 – X 100에 세포를 품어. PBS로 두 번 세포를 세척하고 버퍼를 차단 적용 (2 % 할nkey 혈청, 2 % 소 혈청 알부민, 1 시간 동안 PBS)에 희석 된 50 mM의 글리신. (버퍼 1:10 희석 차단) 작업 버퍼로 세포를 씻으십시오. 작업 버퍼에 항체를 희석. 유리 커버 슬립에 성장 세포의 경우, 60 μl의 총 볼륨의 항체를 희석. 6 잘 접시에 세포를 들어, 600 ㎕의 총 부피의 항체를 희석. 여러 항원을 염색하기 위해 항체의 칵테일을 적용 할 수있다. 대조군으로서, IgG를 사용하거나 특정 항체 대신 면역 혈청을 미리. 차 항체를 사용하는 것으로 제어 샘플은 같은 종에서 컨트롤의 IgG와 함께 배양해야합니다. 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 1.5 시간 중 하나를 기본 항체를 품어 차 항체를 대기음 RT에서 근무하는 버퍼로 3 회 세척한다. 알렉사 결합 된 항체에 대한 1:1,000 – 로다 민과 FITC 결합 된 항체, 1:500에 1:200에​​서 이차 항체를 희석. 그것은 모든 차 항체는 광 감응성하는 것이 중요합니다. 샘플을 커버신호의 손실을 방지하기 위해 알루미늄 호일. 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 옵션 : 핵을 시각화하기 위해, DAPI 보조 배양 동안 1:500 추가 할 수 있습니다. 이는 전체 세포 인구의 단백질 발현의 정량에 유용합니다. 이차 항체를 대기음 RT에서 근무하는 버퍼로 3 회 세척한다. 버퍼에 열중하는 동안 커버 슬립에 성장 세포를 들어, 부드럽게 집게로 커버 슬립을 들어 올려 PBS에 담가 씻는다. 6 잘 접시에서 자란 세포의 경우, PBS 세척 및 흡 인물을 추가 할 수 있습니다. 이 시점에서 그들은 거꾸로 현미경으로 검사 할 준비가 된 것입니다. 과량의 PBS를 제거하는 킴 와이프에 부드럽게 커버 슬립의 가장자리를 터치합니다. 유리 슬라이드에 장착 젤 한 방울을 추가하고 슬라이드에 coverslip에 반전. 흡인 초과 장착 젤을 제거합니다. 거품을 제거하기 위해 200 μL 피펫 팁의 뒤쪽으로 가볍게 커버 슬립을 누릅니다. 4 ° C에서 약 20 분 또는 O / N 실온에서와 플로리다에서 검사 드라이uorescent 또는 공 초점 현미경. 파라핀 ICCS에서 단백질의 3. (선택 사항) 면역 형광 염색법 3 % 아가로 오스 솔루션을 준비하고 시원한에 55 ~ 60 ° C.에게하자 실온에서 5 분 동안 1,500 XG에 15 ML 원뿔 관에 현탁 배양 ICCS, 원심 분리기를 전송합니다. 세포에서 미디어를 기음과 실온에서 10 분 동안 500 ㎕의 4 % PFA로 고정합니다. 펠릿이 매우 큰 경우를 제외하고, 펠릿을 혼합하지 마십시오. 750 ㎕의 PBS로 두 번 펠렛을 씻으십시오. 4 % PFA와 같이,이 폐기물은 위험한 것으로 간주하며, 기관의 유해 폐기물 규정에 따라 처리해야합니다. 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브의 벽 아래로 아가로 오스의 150 ~ 200 μl를 풀고 추가하는 세포 펠렛을 가볍게. 부드럽게 튜브를 가볍게 치면 혼합하지만, 거품을 형성하지 않습니다. 5 ~ 10 분 동안 4 ° C에서 고화 할 수 있습니다. 꺼 내려 21 G 바늘을 사용하여신선한 15 ML 원뿔 관에있는 펠릿과 장소. 슬라이드에 파라핀의 임베딩 및 섹션의 준비는 마이크로톰을 사용하여 현장에서 또는 핵심 현미경 시설에 의해 수행 할 수 있습니다. 조직, 수화물을 Deparaffinize, 신속하게 물로 세척한다. 나머지 알데히드를 해소하기 위해 RT에서 30 분 동안 0.2 M 글리신을 추가합니다. 2 분 각각 PBS로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 항원 검색을 위해, 핫 플레이트를 통해 비등 된 10 mM 구연산 완충액 (pH 6.0)를 가져옵니다. 그것은 다시 익혀까지 기다린 다음 15 분 동안 기다린 버퍼에 슬라이드를 담가. 열판에서 비커를 제거합니다. 버퍼에 냉각 슬라이드 약 40 분을 기다립니다. 5 분마다 H 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으 5 분마다 PBS로 두 번 슬라이드를 씻어 1 시간 동안 PBS 2 % 정상 당나귀 혈청 차단합니다. 0.2 % 트리톤 X-100을 함유하는 버퍼에서 올바른 작업 농도로 희석 차 항체와 함께 배양한다.일반적으로, 기본 항체 밤새 배양 전사 인자에 대한 1.5 시간 동안 염색 한 경우 작은 호르몬, 증식 마커 및 / 또는 분화를 위해 염색. 위에서 설명한 단계 2.3-2.9를 수행합니다.