역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응
Summary
우리는 순차적으로 온 – 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 – 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.
Abstract
방향과 고정 밀도 제어와 생체 활성 작은 분자의 빠른 표면 고정화하는 방법은 바이오 센서 및 마이크로 어레이 응용 프로그램에 매우 바람직하다. 이 연구에서, 우리는 TCO / TZ-유도체 분자의 미세 고정을 가능하게하는 매우 효율적인 공유 bioorthogonal 트랜스 – 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 – 테트라 (Tz 일)를 사용 . 우리는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 연속적인 유동 조건에서 실시간으로 프로세스를 모니터링한다. 리버시블 고정화를 활성화 센서 표면의 실험 범위를 확장하기 위해, 우리는 고리 화 반응과 비공유 항원 항체 캡처 컴포넌트를 배합. 교대 센서 표면에 TCO 또는 Tz 일 잔기를 제시함으로써, 다 캡처-사이클로 공정은 다 성분 다양한 구조의 온 – 칩 어셈블리와 상호 작용 연구를 위해 하나의 센서면에 지금은 가능하다. 우리 나작은 분자, FK506 결합 단백질 12 (FKBP12)를 결합 AP1497, 2 개의 바이오 센서 칩에 다른 고정화 실험으로이 방법을 llustrate과 같은 작은 분자 고정화에 현장 기능화 나노 입자의 일환으로.
Introduction
효율적인 결합 반응은 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 표면에 생체 활성 분자를 연결하는 중요한 도구입니다. 최근 매우 빠른 bioorthogonal 트랜스 – 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 – 테트라 (Tz 일)은 세포 표면, 세포 내 구조, 항체 및 나노 입자를 레이블로 사용 된 1. – 여기에 7, 우리는 표면 플라스 몬 공명 (SPR)의 상호 작용 분석을위한 다 성분 구조의 가역적 인 온 – 칩 합성 항원 / 항체 캡처 (GST / 안티 GST)와 함께 [4 +2] 고리 화 반응을 사용하여 모니터 실시간 프로세스 (그림 1). 새로운 분석의 다양한 리간드의 방향과 밀도를 제어 안정 센서 표면의 결과, 어셈블리로 8,9 특히, 캡처 – 사이클로 전략 수립 프로토콜을 사용하여 표면의 재생을 가능하게한다. 8 형식은 지금 가능합니다. 사용이 전략은 우리는 TCO / TZ-유도 된 작은 분자의 고정화를 설명하고 버퍼 다양한 조건에서 사이클로 속도를 특징. 우리는 직접 고정 된 GST 항원에 부착 할 때 캡처 – 사이클로 전략 목표와 상호 작용하는 작은 분자의 기능을 유지하는지 확인하기 위해 예를 들어 FKBP12 10-12 바인딩 FKBP12 및 분자 AP1497의 잘 알려진 상호 작용을 선택했다 또는 고정 된 나노 입자 공단에.
이 방법은 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 센서 칩에 작은 분자의 가역적 고정이 가능하게되었습니다. 둘째, 작은 분자의 TCO /는 TZ 고정화는 정식 SPR 연구의 방향을 반전 라벨없는 상호 작용의 연구를 가능하게하고, 결합 상호 작용의 상보적인 뷰를 제공 할 수있다. 셋째,이 방법은 대상 나노 입자의 미세 합성, 그들의 bindin의 즉각적인 평가를 가능하게G 속성. 이는 대상 입자를 평가하거나 선별 효율을 향상시키고, 또한 필요한 나노 입자의 양을 감소 약속한다. 넷째 13-15,이 방법은 연속 흐름 하에서 실시간 bioorthogonal 고리 화 반응의 반응 속도를 측정 할 수있다. 마지막으로, TCO /는 TZ 고정화 화학 혈청의 존재하에 강력하다. 이와 함께, 우리는이 다양한 접근 방식은 크게 생체 외 및 생체 내 세포의 응용 프로그램에서의 관련성과 미세 유체 연구의 다양한 안정 센서 표면의 구축을 용이하게 할 것으로 예상.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 캡처 – 사이클로 방법은 라벨이없는 칩 기반의 상호 작용과 운동 연구에 대한 수정 된 나노 입자와 작은 분자의 빠른 가역적 고정 할 수 있습니다. 고정화 프로토콜 <저분자 리간드 10 μM 농도가 필요한 분에서 수행 될 수있다. 리간드 농도 및 접촉 시간 고정화 밀도를 변조함으로써 가깝게 제어 할 수있다. 우리의 데이타는 온칩 bioorthogonal 반응 그들의 표적과 상호 작용하는 동…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NIH (NHLBI 계약 번호 HHSN268201000044C이, SH 및 SYS를 RW하는)에서 자금을 인정합니다.
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Referenzen
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