Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen
Summary
We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.
Abstract
Methodes voor snelle oppervlakte immobilisatie van bioactieve kleine moleculen met controle over de oriëntatie en immobilisatie dichtheid zijn zeer wenselijk voor biosensor en microarray toepassingen. In deze studie, gebruiken we een zeer efficiënte covalente bioorthogonal [4 +2] cycloadditie reactie tussen trans-cyclo (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) de microfluïdische immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde moleculen inschakelen . We volgen het in real time onder continue stroomomstandigheden behulp van oppervlakte-plasmon resonantie (SPR). Omkeerbare immobilisatie inschakelen en verlengen de experimentele bereik van het sensoroppervlak combineren we een niet-covalente antigeen-antilichaam koolstofafvangcomponent de cycloadditiereactie. Door afwisselend presenteren TCO of Tz groepen aan het sensoroppervlak, verschillende capture-cycloadditie processen nu mogelijk aan een sensoroppervlak voor on-chip montage en interactie studies van een groot aantal multi-component structuren. We illustrate deze methode met twee verschillende experimenten immobilisatie op een biosensor chip, een klein molecuul, dat AP1497-FK506 bindend eiwit 12 (FKBP12) bindt, en dezelfde kleine moleculen als deel van een geïmmobiliseerd en in situ gefunctionaliseerde nanodeeltjes.
Introduction
Efficiënte conjugatiereacties zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bevestigen van bioactieve moleculen aan oppervlakken voor diverse biotechnologische toepassingen. Onlangs heeft de zeer snelle bioorthogonal [4 +2] cycloadditiereactie tussen trans-cycloocteen (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) gebruikt om celoppervlak, subcellulaire structuren, antilichamen en nanodeeltjes label 1. – 7 Hier gebruiken we de [4 +2] cycloadditie reactie in combinatie met antigen / antilichaam-capture (GST / anti-GST) voor wisselbaar-chip synthese van multi-component structuren Surface Plasmon Resonance (SPR) interactie analyse en bewaken van de proces in real-time (figuur 1). 8,9 name de capture-cycloadditie strategie maakt oppervlak regeneratie met behulp van een vooraf vastgesteld protocol. 8 Als gevolg, assemblage van stabiele sensor oppervlakken met controle over ligand oriëntatie en dichtheid voor tal van nieuwe assay formaten is nu mogelijk. Gebruikdeze strategie laten we de immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde kleine moleculen karakteriseren cycloadditie prijzen in verschillende buffer omstandigheden. We kozen voor het bekende interactie tussen FKBP12 en een molecuul AP1497 dat FKBP12 10-12 bindt als een voorbeeld om na te gaan of de capture-cycloadditie strategie behoudt het vermogen van de kleine molecule om te communiceren met de doelgroep wanneer hetzij rechtstreeks aangesloten op geïmmobiliseerde GST antigenen of aan geïmmobiliseerd nanodeeltjes (NP).
Deze methode biedt een aantal voordelen. Ten eerste, de omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen op sensorchips is nu mogelijk. Ten tweede, TCO / Tz immobilisatie van kleine moleculen maakt ook label-free interactiestudies dat de oriëntatie van canonieke SPR studies te keren, en kunnen een aanvullende weergave van een bindende interactie. Ten derde, deze methode kan de microfluïdische synthese van gerichte nanodeeltjes en onmiddellijke evaluatie van de binding eigenschappen. Dit belooft de efficiëntie te evalueren of screenen gericht nanoparticles verbeteren en tevens de hoeveelheid nanodeeltjes vereist verminderen. 13-15 vierde kan deze benadering de reactiekinetiek van bioorthogonal cycloadditiereacties meten realtime onder continue stroom. Ten slotte TCO / Tz immobilisatie chemie is robuust in aanwezigheid van serum. Samengevat, verwachten we dat deze veelzijdige benadering constructie van stabiele sensor oppervlakken uiteenlopende microfluïdische studies relevante in vitro en in vivo cellulaire toepassingen algemeen zal vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De capture-cycloadditiereactie hier beschreven methode maakt een snelle, omkeerbare immobilisatie van gemodificeerde nanodeeltjes en kleine moleculen voor label-free-chip gebaseerde interactie en kinetische studies. De immobilisatie protocol kan worden uitgevoerd minuten ter <10 uM concentratie van kleine moleculen liganden. Door het moduleren van ligand concentratie en contacttijd immobilisatie dichtheden nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Onze gegevens tonen aan dat on-chip bioorthogonal reacties behoud van de mo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen financiering van NIH (NHLBI Contract No HHSN268201000044C naar RW, SH en SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Referenzen
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
