复用荧光微阵列人类唾液蛋白质分析用高分子微球和光纤束
Summary
我们描述了使用多路复用基于微球的抗体阵列分析唾液蛋白的过程。单克隆抗体共价连接到荧光染料编码的4.5微米聚合物用碳二亚胺化学性微球。修改后的微球沉积在光纤的微孔用荧光夹心免疫测定蛋白水平在唾液。
Abstract
本文中，我们描述了一种协议，用于同时测量6蛋白在唾液中使用的光纤基于微球的抗体阵列。所采用的免疫阵列技术结合基于微球的悬浮阵列制造与使用荧光显微镜的优点。如在视频协议描述的，可商购的4.5微米的聚合物微球进行编码成七种不同类型的，由两个荧光染料物理截留在微球内的浓度分化。表面含羧基的编码微球通过EDC / NHS偶联化学进行了修改，用单克隆捕获抗体。组装的蛋白质微阵列，不同类型的编码和官能化的微球混合，并随机地沉积在4.5微米的微孔，从而进行化学蚀刻在一光纤束的近端。光纤束被用来同时作为载体和用于成像的米icrospheres。一旦组装后，该微阵列用于捕获蛋白在从诊所收集唾液上清液。该检测是基于使用生物素化的检测抗体的混合物为不同的分析物与链霉亲和结合的荧光探针，R-藻红蛋白的夹心免疫测定。微阵列是在三个不同的通道，两个对微球的注册和一个用于检测信号成像，荧光显微镜。的荧光显微照片，然后解码，并在MATLAB中使用自制的算法进行分析。
Introduction
由于报道由Mark Schena并在90年代中期的同事第一芯片，这个强大的工具已被用于生物研究1的许多领域。能够同时检测多种蛋白质在诊断液，如血液的抗体微阵列，具有在临床诊断和生物标志物筛选2-10重要的应用。唾液，含有许多相同的分析物如血，一直被认为是一个优选的替代方案，因为血液唾液收集是安全的，非侵入性的，并且可以进行通过微创医疗人员11-13。目前，使用唾液样本复用蛋白分析是由几个重要的因素，其中包括目标分析物14的低浓度和不同的生物标记物15的宽浓度范围的限制。
。在此，我们证明6种蛋白的分析：人血管内皮生长因子（VEGF），干扰素γ-诱导蛋白10（IP-10），白细胞介素-8（IL-8），表皮生长因子（EGF），基质金属蛋白酶9（MMP-9），和白细胞介素-1β（IL-1β） 。该方法的性能用标准溶液构成的重组蛋白分析物和封闭缓冲液中最初验证。从不同的慢性呼吸系统疾病的患者以及健康对照真正的唾液样本进行了测试表现令人满意。该协议应当适用于其他蛋白质的分析物和其他基于微球的实验。该平台提供了相当大的优势，在分析化学领域，因为它使低浓度的几种蛋白质具有广泛的动态范围，最小的非特异性相互作用，减少样品消耗和低成本的快速，精确，可重复的和同时分析在比较的类似的酶联免疫吸附试验（ELISA）。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究者应该格外注意以下步骤：为更好的解码精度，有必要验证微球均匀地悬浮在所有孵育和微球编码过程中的洗涤步骤。此外，经编码的微球需要在整个实验中，以避光。下列正确的编码和储存程序中，我们发现，总体解码准确率为99％以上。该编码微球应保存在4℃保存，避免冷冻和避光。在适当的储存条件下，编码微球是稳定超过六个月。在编码和修改步骤，需要格外小心，以?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院（补助08UDE017788-05）的支持。 EBP也承认支持西班牙基金会科学与技术（FECYT）。作者感谢人Shonda T.盖洛德和Pratyusha Mogalisetti的手稿的批判性阅读。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Referenzen
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