Infinium Assay voor grootschalige SNP genotypering Toepassingen

Day One 1. Voorbereiding Doseer 200 ng van DNA in een diepe put, 96-sample plaat. Ten minste 96 monsters (volledige platen) worden uitgeplaat om te verzekeren geen reagens wordt verspild. Label de plaat met een door de kit barcode sticker en centrifuge het. Om het volume normaliseren, laat de monsters in een lade of zuurkast gedurende de nacht de vloeistof verdampen. Bedek de plaat losjes af met een deksel of een papieren handdoek om stof buiten te houden. 2. Amplification WAARSCHUWING: monsters moeten ondergaan versterking tenzij 4 uur beschikbaar zal zijn op de volgende dag voor de fragmentatie, neerslag, en resuspensie stappen. Verwijder de box-bedrijf geleverde of pak van buizen label "Pre" van de -20 ° C vriezer (een tube van MA1, MA2, en MSM is voldoende voor elke set van 96 monsters). Set buizen van MA2 en MSM op de bank te ontdooien. Zet goed gekalibreerdoven ingesteld op 37 ° C. Met behulp van een reagens bekken en een 10 ul, 8-kanaals pipet, afzien 4 pi DNA hersuspensiebuffer in elk putje om de monsters te rehydrateren. Het is niet noodzakelijk pipetpunten tussen elke kolom weggooien als zorg wordt besteed niet aanraakt vloeistof. Met een 8-kanaals pipet, afzien 20 ul van MA1 in elk putje van de plaat. Voor elke nieuwe reagens, gebruik dan een vers oplosmiddel bassin. Bedek de plaat met een herbruikbare verbinding, puls-centrifuge en vortex gedurende 1 min bij 1600 rpm op een microplaat schudinrichting. 2.4) Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Doseer 4 pl 0,1 N NaOH aan elk putje van de plaat. Bedek de plaat met de herbruikbare zegel, pols-centrifuge, en vortex gedurende 1 minuut bij 1600 rpm. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Doseer 34 ul van MA2 in elk putje van de plaat. Doseer 38 ul van MSM in elk putje van de plaat. Bedek de plaat met deherbruikbare zegel, puls-centrifuge, en vortex gedurende 1 minuut bij 1600 rpm. Plaats in de oven gedurende 20-24 uur. Day Two 3. Fragmentatie Verwijder FMS buizen uit de "Post-1" -20 ° C box (een tube is voldoende voor elke set van 96 monsters). Ontdooien op de bank of in een kamer-temperatuur waterbad. Na het inbrengen van de MIDI-plaat inzetstuk in een tafelblad microproefcel incubatiesysteem, zet het vuur blok en ingesteld op 37 ° C. Zodra buizen worden ontdooid, verwijderen monster plaat uit de oven en pulse-centrifuge. Pipetteer 25 ul van FMS in elk putje van de plaat DNA. Plaats het deksel, pols-centrifuge, en vortex op 1.600 rpm gedurende 1 minuut. Incubeer plaat in warmteblok gedurende 1 uur. 4. Neerslag Verwijder PM1 tube van "Post-3" 4 ° C doos of pak en opwarmen tot kamertemperatuur (een tube is voldoende voor elke set van 96 monsters). Verwijder de plaat van het vuur block en pulse-centrifuge. Pipetteer 50 ul van PM1 in elk putje van de plaat. Plaats het deksel, pols-centrifuge, en vortex op 1.600 rpm gedurende 1 minuut. Incubeer plaat in warmteblok gedurende 5 minuten. Verwijder de plaat uit hitte blok, zet het uit, en de plaat deksel verwijderen. Pipetteer 155 ul 100% isopropanol in elk putje van de plaat. Dek goed af met een nieuw deksel en handmatig draai de plaat meerdere keren te mengen. Plaats plaat 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Schakel gekoelde centrifuge en ingesteld tot 4 ° C afkoelen. Balans de plaat en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 min bij 3000 x g. Inspecteer de onderkant van de plaat zonder omkeren deze en bevestigt de monsters worden neergeslagen in een blauwe pellet. Indien geen korrels meer zichtbaar, centrifuge. Krijgen papieren handdoeken. Gooi het deksel en snel te verwijderen van de vloeistof door het omkeren van de plaat en krachtig te tikken op de stationaire bedekt met papieren handdoeken. Zodra de plaat is inverted, let er dan op het terugkeren, terwijl een vloeistof blijft. Tik herhaaldelijk op de plaat tegen de stationaire totdat alle vloeistof wordt verwijderd. Plaats de plaat op een reageerbuis rek, omgekeerd, te drogen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. 5. Resuspensie Verwijder RA1 van "Post-2" -20 ° C doos en dooi in water op kamertemperatuur bad. Zet de oven aan en stel deze in op 48 ° C. Eenmaal ontdooid, afzien 23 ul van RA1 aan elk putje van de monsterplaat. Laat de hele fles van RA1 niet giet het in het bekken; bespaart 30 ml voor later. Als de monsters zullen worden gehybridiseerd op de arrays later die dag, plaatst de RA1 in een 4 ° C koeler. Als de monsters op een later tijdstip zal worden uitgevoerd, het etiket van de fles en opnieuw invriezen de RA1. Warmte-zegel een nieuw deksel op de plaat. Pulse-centrifuge de plaat en plaats het in de oven gedurende 1 uur. Neem de plaat uit de oven en vortex bij 1.800 rpm gedurende 1 minuut. De monsters kunnen veilig h bedrageneld in dit stadium voor maximaal een week. Platen kunnen worden opgeslagen, en de monsters kunnen worden gereorganiseerd voor te bereiden op de kraal chip toepassing, indien nodig. Als u doorgaat met de procedure, laat de plaat bij kamertemperatuur en zet het vuur blok. Anders, bewaar de plaat bij -20 ° C. 6. Hybridisatie WAARSCHUWING: Monsters mogen niet hybridisatie ondergaan tenzij 5,5 uur zijn beschikbaar op de volgende dag voor de kleuring en wassen stappen. Zet het vuur blok en stel deze in op 95 ° C. Zet de oven aan en stel deze in op 48 ° C. Zodra de temperatuur is gestabiliseerd, incubeer de plaat op het vuur blok gedurende 20 minuten. Terwijl de plaat wordt denatureren, verwijdert u de doos van de kraal chips van 4 ° C en zet het op de bank. Pak een flesje XC4 (van kamer-temperatuur kit) en voeg 330 ml 100% ethanol. Schud het goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende de nacht. Bereid formamide / EDTA mix (95% formamide, 0,2TA (0,5 M), 4,8% H 2 O in volume) en vries in stappen aparte 15 ml. Overmaat formamide worden opgeslagen. Verwijder het monster plaat uit de hitte blok. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Terwijl de plaat afkoelen, bereiden de hyb kamer. Een kamer nodig zullen zijn voor elke vier kraal chips verwerkt. Plaats een rubberen mat op de bovenkant van de hyb onderplaat, uitlijnen van de dikkere gat met de voorkant van de basis. De barcode symbool geëtst in de bodem moet nog steeds zichtbaar (zie figuur 2). Met behulp van een 1000 ui pipet, afzien 400 ul van PB2 in elk van de acht bevochtigen reservoirs gesneden in de basis. PB2 is te vinden in "Post-3" doos of verpakking. Plaats de hyb kamer deksel op de basis en gesp beide uiteinden door het sluiten van twee gespen op diagonaal tegenover elkaar als eerste. Verwijder de afzonderlijke verpakkingen zilveren kraal chips van de respectievelijke vakken, maar om de expo chips minimaliserenervoor dat lucht en licht, nog niet te openen. Scan zorgvuldig de barcodes van de chips en noteer de volgorde waarin ze op een tracking blad zal worden geladen, samen met de doos id waar ze vandaan kwamen. Een goed begrip van waar elk individueel DNA-staal wordt afgegeven op de korrel chips nodig. Verwijder de afzonderlijke verpakkingen zilveren kraal chips van de respectievelijke vakken, maar om de blootstelling van de chips om lucht en licht te minimaliseren, nog niet te openen. Scan zorgvuldig de barcodes van de chips en noteer de volgorde waarin ze op een tracking blad zal worden geladen, samen met de doos id waar ze vandaan kwamen. Een goed begrip van waar elk individueel DNA-staal wordt afgegeven op de korrel chips nodig. Net voor de 30 min afkoelen is voltooid, opent de zilveren kraal chip packs. Haal de chips uit hun doorzichtige plastic kokers. Zonder het aanraken van de kralen, plaatst elke kraal chip op een hyb kamer inzetstuk, het oriënteren van de chipbarcode met de barcode symbool geëtst in de insert top oppervlak. Pellen en het deksel van het monster plaat verwijderen. Neem 15 pi monster van de monsterplaat en langzaam afzien van de inlaat naar de matrix (zie figuur 3). Buitengewone zorg moet worden genomen om de juiste monster op de juiste kraal chip in de juiste positie, passend bij de hiel chip volgorde eerder. Een multichannel pipet kan worden gebruikt om vloeistof afgeven op de chips, maar voorzorg worden genomen om alleen het aantal monsters dat op de korrel chip veilig kan worden geplaatst, zuig het aantal rijen op een plaat niet altijd overeen met het aantal rijen op een chip. Eens in de steekproef heeft op de bijbehorende matrix geplaatst visueel op de chip voor bellen of regio's niet gecoat in vloeistof. Als deze problemen bestaan, schud de insert. Indien nodig kunnen meer vloeistof worden toegevoegd array. Zorg ervoor dat de juiste DNA-monster toe te voegen. Open de hyb kamer eenD Plaats de inserts over de bevochtiging reservoirs. De barcode van de chip moet over de barcode geëtst in de hyb kamer voetstuk worden geplaatst. Vervang de hyb afdekklepje en sluit alle vier klemmetjes door het sluiten van de haakjes op diagonaal tegenover elkaar als eerste. Incubeer de hyb kamer in de oven gedurende 16-24 uur. Let op dat de kamers niet te kantelen wanneer ze in beweging. Als meer dan een plaat moet worden verwerkt, terug naar stap 6.2. Verwerking van meer dan 24 kraal chips in een dag wordt afgeraden om zowel het minimaliseren van de kans op menselijke fouten bij het hanteren van een grote hoeveelheid van verbruiksgoederen of chips en de hoeveelheid tijd die nodig is om de chips te verwerken in toekomstige stappen te minimaliseren, zoals zorg moet worden ondernomen om de blootstelling aan lucht zoveel mogelijk te beperken. Een fles XC4 is voldoende voor maximaal 24 kraal chips. Dag Drie 7. Kleuring Voorbereiding Verwijder de hyb kamers uit de oven en incubeer bij kamertemperatuur temperature voor 25 min. Als het verwerken van meer dan twee hyb kamers, waggelen hun dubbele verwijdering elke 10 minuten. Om de chips uitdrogen, maar niet de hyb kamers kan openen. Terwijl de hyb kamers zijn koeling, verwijderen tubes XC1, XC2, TEM, STM en een geldautomaat van de "Post-1" -20 ° C en stel op de bank te ontdooien. Pak een flesje RA1 van de "Post-2" box bij -20 ° C (of 4 ° C als het hergebruik van de reagens van de vorige dag) en dooi in een kamer temperatuur waterbad. Ontdooi een buis van 95% formamide ook. Tot 8 kraal chips verwerkt, twee buizen van elk reagens 10 ml RA1, 15 ml formamide en 150 ml XC3 (in een kamer-temperatuur-bedrijf leverde box) nodig. Voor elke chip verwerkt, wordt een glasplaatje, een plastic doorstroom brace, twee metalen klemmen, en een plastic spacer nodig. Voor de plastic spacer, gebruik dan alleen de duidelijke een, scheiden en gooi de ondoorzichtige spacer. Bovendien zijn er twee kralen chip wassen gerechten eneen kraal chip tray nodig zal zijn, samen met een vloeistof verzamelplaats en een plastic montage bar. Reinig de glazen plaatjes door te besproeien ze met ethanol en vegen ze droog. Zet de hete waterbad dat is verbonden aan de doorstroming kamer rack en stel deze in op 44 ° C. Schud de kamer rek om eventuele luchtbellen te verwijderen. Wanneer de hyb kamer is afgekoeld gedurende 25 min, vul een wassen schotel met PB1 (ongeveer 200 ml). PB1 is te vinden in de "Post-4" kamertemperatuur doos. Open een hyb kamer. Verwijder het deksel afdichting van een kraal chip door het grijpen van de afdichting in een hoek en voorzichtig schillen diagonaal (zie figuur 4). Zodra het zegel wordt verwijderd, onmiddellijk plaats de chip in een kraal chip tray en dompel in PB1 zonder het aanraken van de kralen. Herhaal dit totdat de lade is gevuld met kraal chips, het verzorgen elke chip droog niet te laten. Schud voorzichtig de lade om eventuele luchtbellen te verwijderen en laat de chips onder water gedurende 1 minuut.Vul een tweede wasbeurt schotel met PB1. Schud de lade weer. Breng de lade van de kraal chips in de tweede wasbeurt gerecht. Schud voorzichtig en laat inwerken gedurende 1 minuut, dan weer schudden. In de vloeistof doorstroming verzamelplaats plaatst vier zwarte kunststof doorstroming bretels in de groeven. Vul het station met PB1 tot de vloeistof nagenoeg de hoogte van de acht montagebeugels (ongeveer 150 ml) bereikt. Verwijder een kraal chip uit de lade en plaats deze in de verzamelplaats op een plastic doorstroom brace. De chip barcode moet boven de streepjescode symbool geëtst in de verzamelplaats worden uitgelijnd. Herhaal dit voor de andere drie chips die past binnen de verzamelplaats. Plaats een doorzichtige plastic spacer bovenop een kraal chip. De buitenranden van de spacer moet de beugels omgeven binnen de verzamelplaats. Herhaal dit voor de andere chips ondergedompeld in de PB1. Plaats de plastic montage bar in de verzamelplaats door het aanbrengen van het over de groeven. Plaats voorzichtig een glasplaatje bovenop de plastic spacer door op de achterzijde van de schuif tegen het samenstel bar en langzaam zakken voren in de vloeistof. De groef aan de bovenkant van de dia moet naar beneden wijzen, direct boven de barcode van de chip, met een afstand tussen de hiel chip en de schuif op de streepjescode einde. Herhaal dit voor de andere chips ondergedompeld in de PB1. Voor een volledige doorstroom montage schema, zie figuur 5. Controleer op luchtbellen tussen de chip en glijbaan. Als er bellen verschijnen, voorzichtig omhoog de glijbaan op de streepjescode einde en probeer het opnieuw. Aanhoudende bubbels kan worden schoongemaakt, zodat de glazen met een papieren handdoek laboratorium (Kimwipe). Snap twee metalen klemmen rond de glasplaatje, een tegen de streepjescode uiteinde en een naar achteren. De randen van de klemmen moet het plastic handvat doorstroom brace onder de chip. Herhaal dit voor elke chip ondergedompeld in PB1. Verwijder de voltooide doorstroming samenstellingen en plaats horizontaal op de bench. Zorg ervoor dat u de montage verticaal kantelen, waardoor de vloeistof onder het glaasje te ontsnappen. Indien meer chips wachten in de was bak, kunnen ze worden samengesteld onder dezelfde PB1. Als andere chips wachten in hun oorspronkelijke hyb kamers, verwerp alle vloeistof in de verzamelplaats en afwassen, en terug te keren naar stap 7.6. Zodra alle kralen chips in hun doorstroom samenstellingen, neem een ​​paar chirurgische schaar en knip beide uiteinden van de afstandhouder uit, zo dicht mogelijk bij het glaasje mogelijk. 8. Kleuring en Extension Controleer of de doorstroming kamer rack heeft bereikt 44 ° C in meerdere posities met een temperatuursonde. Als de temperatuur af met meer dan een halve graad, stel de temperatuur van het waterbad. Plaats een kraal chip doorstroom montage op de kamer rek door het schuiven van de assemblage naar beneden en het aansluiten van de beugel aan de bovenkant. De achterzijde van de kraal chip mag aanraken de kamer rek. Het glass dia moet worden naar buiten gericht, met de groef aan de bovenkant om een ​​reagens reservoir vormen. Herhaal dit voor elke kraal chip montage. Met een 200 ul pipet 150 ul RA1to de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 30 sec. Herhaal 5x. Met een 1.000 III pipet 450 ul XC1to de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten. Voeg 450 ul XC2 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten. Voeg 200 ul TEM de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 15 minuten. Voeg 450 ul 95% formamide / EDTA mix de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten. Stel het hete waterbad om de temperatuur lIsted op de buizen van STM (of 37 ° C als er geen wordt weergegeven). Zorg ervoor dat elke STM buis heeft de beursgenoteerde dezelfde temperatuur. Voeg 450 ul XC3 de doorstroming samenstellingen. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen. Wanneer het hete waterbad temperatuur de gewenste temperatuur heeft bereikt, voeg 250 μLSTM de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten. Voeg 450 ul XC3 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten. Voeg 250 ul ATM de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten. Voeg 450 ul XC3 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten. Voeg 250 ul STM de doorstromingvergaderingen door het afgeven van de vloeistof in het glas reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten. Add4 50 ul XC3 de doorstroming samenstellen door afgeven van de vloeistof in het glazen reservoir. Incubeer gedurende 1 minuut. 1x herhalen. Incubeer de doorstroming assemblages voor 5 minuten. Herhaal de stappen 8,14-8,19 1x. Verwijder de doorstroom assemblages uit de kamer rek en zet het waterbad. 9. Wassen en Afdichting Vul een kleuring kraal chip wassen schotel met PB1 (ongeveer 315 ml). Twee verticaal was gerechten en een verticale kraal chip tray nodig zal zijn, samen met ten minste een vacuüm spruitstuk. Demonteer een doorstroom montage door het invoegen van een dunne metalen staaf tussen de gespen en de brace en dan zwenken. Vernietiging van het glasplaatje en verwijder de kraal chip. Plaats onmiddellijk de kraal chip in de verticale kraal chip tray en onder te dompelen in PB1. Herhaal dit voor elke doorstroming assemblage, en zorg ervoor eac gezichth kraal chip in dezelfde richting en hun blootstelling aan lucht minimaliseren. Schud voorzichtig de kraal chip tray om luchtbellen te verwijderen. Incubeer de verzonken kraal chips in PB1 gedurende 5 minuten. Vul het tweede verticaal was gerecht met de XC4 bereid de vorige dag. Schud de kraal chip tray weer. Beweeg de kraal chip lade om het wassen schotel gevuld met XC4. Schud voorzichtig de lade om luchtbellen te verwijderen. Incubeer gedurende 5 minuten en schud opnieuw. In een vloeiende beweging, trek de hiel chip lade uit de wassen schotel en zet op een reageerbuis rek, zodat de kralen op elke kraal chip gezicht naar boven. Met zelfsluitende pincet, schuift een bead chip uit de lade en plaats op een reageerbuis rek. Herhaal dit voor elke kraal chip. Breng zorgvuldig de reageerbuis rek chips om een ​​vacuumexsiccator. Sluiten en zet de stofzuiger, zorgen voor een goede afdichting. Incubeer gedurende 50-55 minuten. Indien nodig, kan de scanner tijdens incubatie. 10. Het scannen Turn uit het vacuüm en langzaam terug de druk tot atmosferische. Controleer of de kraal chips droog zijn. Indien nodig, veeg de randen en onderkant van de chip met een papieren handdoek om een ​​vloeibaar of vuil te verwijderen. Activeer de scansoftware en bewegen kraal chips te scannen lade. Download decoderen van bestanden van de chip (dmaps) door het activeren van de Decode Bestand Client-software en het invoeren van de gewenste kraal chip barcodes, samen met hun overeenkomstige vakje ID's. Niet-gescande kraal chips kan veilig in een droge, donkere ruimte worden opgeslagen voor maximaal 72 uur. Zodra de chips goed zijn geplaatst in de lade en het decoderen bestanden worden herkend door de software, start het scannen.