Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

O sistema imunitário é constituído por duas ramificações: a imunidade inata e adaptativa. A imunidade inata é evolutivamente mais antiga do que a imunidade adaptativa. Invertebrados são atualmente pensado para ter só a imunidade inata, enquanto os vertebrados possuem ambos os ramos inata e adaptativa. Enquanto a imunidade adaptativa confere imunidade específica e de longa duração a certos patógenos, a imunidade inata é uma resposta imediata às bactérias invasoras, vírus e fungos. Um aspecto importante da resposta imune inata envolve a libertação de citocinas e quimiocinas, o que resulta em inflamação e recrutamento de fagócitos (por exemplo, macrófagos, neutrófilos) para engolir e destruir invasores estranhos.

Respostas imune inata de sucesso envolvem: (1) o reconhecimento de microorganismos invasores, (2) indução das cascatas de sinalização adequadas (por exemplo, liberação de citocinas e quimiocinas), (3) desenvolvimento adequado / número adequado de células fagocíticas, (4) Migração de fagócitos para locais de infecção; (5) imersão de patógenos, e (6) a destruição de microorganismos engoliram. Uma deficiência em qualquer uma dessas etapas pode levar ao host que está sendo oprimido por e sucumbir a, a infecção. Uma resposta imune inata robusta é vital para a saúde dos organismos, porque é a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, em todas as plantas e animais. Nos vertebrados, também potencia a resposta imune adaptativa ^1. Portanto, é fundamental que nós somos capazes de avaliar todos os aspectos da resposta imune inata, a fim de entendê-lo melhor e para optimizar a sua função.

Muitos organismos modelo são usados ​​para estudar a imunidade inata, que vão desde a Arabadopsis C. elegans, Drosophila a ratos para as células humanas em cultura. Uma vantagem de se utilizar o peixe-zebra (Danio rerio) sistema modelo para o estudo da imunidade inata é que o peixe-zebra é um vertebrado, com tanto inata e adaptativa imdade, mas o desenvolvimento da imunidade inata e adaptativa são temporalmente segregados. Zebrafish dependa exclusivamente de imunidade inata para a proteção contra a infecção até que a imunidade adaptativa torna-se totalmente funcional, que ocorre cerca de 4-6 semanas após a fertilização ^2. Além de ferramentas para a manipulação genética, a claridade óptica e rápido desenvolvimento, externa, a imunidade inata como o modo de princípio de defesa em embriões de peixe-zebra fornece um modelo simplificado para se estudar a complexidade da resposta imune inata in vivo.

Vários protocolos têm sido desenvolvidas para avaliar diferentes facetas da resposta imune inata em embriões de peixe-zebra. Microarrays e RNAseq validaram que os perfis de citoquinas induzidas pela resposta imune inata do peixe-zebra são semelhantes aos de humanos e têm também sugerido o envolvimento de genes inesperados na imunidade inata ^3,4. A transparência do embrião de peixe-zebra e fluorescente, transgénicacepas ic de patógenos e zebrafish permitir a visualização de interações patógeno-hospedeiro dinâmicos in vivo em tempo real. Embriões de peixes-zebra transgénicos que expressam a GFP sob o controlo do promotor específico de mieloperoxidase de neutrófilos ^5,6 ou o MPEG1 promotor específico de macrófago ⁷ tornaram possível visualizar e quantificar a migração dos fagócitos para os locais de infecções localizadas ^8, bem como para visualizar a fagocitose e destruição de marcada com fluorescência patógenos ^8,9. Embriões de peixes-zebra também são susceptíveis à geração de ensaios de alto rendimento e telas químicos. Por conseguinte, recentemente, têm sido desenvolvidos métodos de alto rendimento de análise do transcriptoma por infecção ¹⁰ e fagócitos migração para os locais de lesão induzida quimicamente ^11.

Das técnicas listadas acima, nenhum avaliar quantitativamente a fase final de destruição patógeno pelos fagócitos. Esta fase finalenvolve uma explosão respiratória (ou seja, produção de ROS e outros compostos tóxicos), que matam os patógenos engoliram. A enzima NADPH-oxidase é uma importante fonte de ROS nas células fagocíticas. Montagem das subunidades dos resultados da enzima NADPH-oxidase de transferência de electrões para o oxigénio, a geração de superóxido. Por meio de reacções enzimáticas subsequentes, superóxido pode então ser convertido em peróxido de hidrogénio e ácido hipocloroso (Figura 1A). É o colapso respiratório de fagócitos que mata organismos patogénicos e assim, a quantificação do potencial de explosão respiratória de embriões de peixes-zebra é indicativo de saúde global imune inata. Foi desenvolvido um ensaio baseado em fluorescência para quantificar a explosão respiratória em grupos de embriões de peixes-zebra individuais ^12. Este ensaio utiliza a forma não-fluorescente, reduzida de um corante disponível comercialmente, de células-permeável. Este corante, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), é convertido para o fluocomposto cento, 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCF), por oxidação. As diversas ROS geradas pela explosão respiratória dos fagócitos podem oxidar H2DCFDA e gerar fluorescência ^24. O aparecimento de fluorescência pode ser utilizado para quantificar e comparar a resposta de explosão respiratória entre grupos de peixe-zebra. A proteína quinase C de etilo agonista de miristato de forbol (PMA) é utilizado para induzir quimicamente NADPH-oxidase para a produção de ROS e, assim, aumentar as leituras de fluorescência (Figura 1B). Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado de uma versão modificada e optimizada deste ensaio explosão respiratória embrião do peixe-zebra. Este ensaio pode ser utilizado para comparar a explosão respiratória entre grupos de embriões de peixes-zebra individuais ao longo do tempo e / ou em resposta a manipulações experimentais (por exemplo, proteína de knockdown morfolino-mediada). O uso deste método, em conjunto com outros ensaios de imunidade inata peixe-zebra, irá fornecer uma imagem mais completa do complexo e críticoresposta imune inata.