एक टेट्रासाइक्लिन विनियमित सेल लाइन विशेष रूप से वृक्ष के समान कोशिकाओं को लक्षित है कि उच्च टिटर lentiviral वैक्टर का उत्पादन
Summary
यहाँ, हम रेट्रोवायरल पारगमन और टेट्रासाइक्लिन के अभाव में एक lentiviral वेक्टर (एल.वी.) के घटक व्यक्त कर सकते हैं कि एक सेल लाइन बनाने के लिए concatemeric अभिकर्मक का उपयोग करें. इस एल.वी. GFP encodes और वृक्ष के समान कोशिकाओं पर एक रिसेप्टर के लिए विशिष्ट है जो एक ग्लाइकोप्रोटीन, SVGmu, साथ छद्म है.
Abstract
Lentiviral वैक्टर (LVS) कोशिकाओं के कई प्रकार के आनुवंशिक सामग्री पहुंचाने का एक शक्तिशाली साधन हैं. LVS की बड़ी मात्रा में उत्पादन, इन एचआईवी -1 व्युत्पन्न वैक्टर के साथ जुड़े सुरक्षा चिंताओं की वजह से चुनौती दे रहा है. इस पत्र में, हम स्वयं निष्क्रिय LVS के उच्च titers के उत्पादन के लिए एक विधि की रिपोर्ट. हम retrovirally एक वृक्ष के समान सेल विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन, SVGmu सहित सभी वायरल घटकों, व्यक्त कर सकते हैं जो एक सेल लाइन, जीपीआरएस, उत्पन्न करने के लिए टीईटी बंद स्थिर निर्माता सेल लाइन जीपीआर transduce. फिर, हम एल.वी. हस्तांतरण प्लाज्मिड एन्कोडिंग एक चयन मार्कर के साथ संयोजन में एक पत्रकार जीन GFP transfect करने concatemeric डीएनए अभिकर्मक का उपयोग करें. परिणामस्वरूप क्लोन के कई हम क्षणिक अभिकर्मक के साथ क्या हासिल की तुलना में 10 गुना अधिक से अधिक एक टिटर पर एल.वी. उत्पादन कर सकते हैं. इसके अलावा, इन वायरस कुशलतापूर्वक इन विट्रो में वृक्ष के समान कोशिकाओं transduce और हमारे संवाददाता प्रतिजन के लिए एक मजबूत टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं. इस पद्धति का एक अच्छा विकल्प के लिए हो सकता हैआर कैंसर या संक्रामक रोगों के नैदानिक अध्ययन के लिए मजबूत एल.वी. आधारित टीके के उत्पादन.
Introduction
कई वेक्टर सिस्टम जीन डिलीवरी के लिए विकसित किया गया है. Lentiviruses पर आधारित वैक्टर सबसे अधिक अध्ययन वायरल व्यवस्था के बीच किया गया है. वे कुशलता, 1 कोशिकाओं को विभाजित और गैर विभाजित दोनों transduce कारण मेजबान जीनोम में एकीकरण के लिए लंबी अवधि की अभिव्यक्ति को प्राप्त है, सबसे अधिक मानव आबादी 2 में कम प्राकृतिक विरोधी वेक्टर प्रतिरोधक क्षमता का प्रदर्शन, और के लिए एक कम क्षमता है सकते हैं क्योंकि ये वैक्टर फायदेमंद हैं insertional mutagenesis के 3,4 से genotoxicity.
Lentiviruses का उत्पादन हमेशा सुरक्षा चिंताओं से रंग दिया गया है. Lentiviral वैक्टर आम तौर पर एचआईवी -1, एड्स के हेतुकविज्ञानी से निकाली गई है. Lentivector के व्यक्तिगत घटकों (हस्तांतरण, लिफाफा, और पैकेजिंग प्लास्मिड) के क्षणिक अभिकर्मक प्रयोगशाला सेटिंग्स में आनुवंशिक सामग्री वितरित की एक आम और लचीला साधन है. हालांकि, नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए स्केलिंग अप क्षणिक transfections के बोझिल और मा हैवाई प्रतिकृति-सक्षम lentivirus 5,6 के विकास के लिए नेतृत्व. इन बाधाओं को पार करने के लिए, कई स्थिर पैकेजिंग और निर्माता सेल लाइनों 6-11 विकसित किया गया है. इन लाइनों में से एक, जीपीआर पैकेजिंग लाइन 11, टेट्रासाइक्लिन द्वारा नियंत्रित किया जा रहा है की आकर्षक लाभ है. इस पत्र में, हम विशेष रूप से वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी LVS) 12 की ओर लक्षित कर रहे हैं कि आत्म – निष्क्रिय lentiviral वैक्टर निर्माण करने के लिए इस प्रणाली को अनुकूलित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.
वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) प्रतिरक्षा प्रणाली की सबसे मजबूत प्रतिजन कोशिकाओं पेश कर रहे हैं. वे सीधे, कार्यक्रम आरंभ, और ट्यूमर विशेष प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 13 को विनियमित क्योंकि वे कैंसर के टीके के विकास में बहुत रुचि का विषय रहा है. डीसी पेप्टाइड या डीएनए टीके की तुलना में मजबूत अर्बुदरोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने की क्षमता है शामिल करने के लिए एक टीकाकरण प्रोटोकॉल शामिल है. हाल ही में, हम एक lentiviral वेक्टर विकसित किया है कि specifically एक संशोधित Sindbis वायरस ग्लाइकोप्रोटीन, SVGmu 14 के माध्यम से वृक्ष के समान कोशिकाओं लक्ष्य. वे वृक्ष के समान कोशिकाओं को उच्च विशिष्टता दिखाने के लिए और अविशिष्ट, VSVg-छद्म वैक्टर की तुलना में मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न उस में ये वैक्टर अद्वितीय हैं.
यहाँ, हम इन डीसी लक्षित lentiviral वैक्टर की बड़ी मात्रा में उत्पादन के लिए एक विधि की रिपोर्ट. हम इन डीसी LVS डीसी को संक्रमित और मजबूत CD8 + टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है. जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं यूएससी Intitutional पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत, नम्रता से प्रदर्शन किया गया. विवो और नैदानिक प्रयोगों में प्रदर्शन करने के लिए आदेश में, यह एक उच्च टिटर पर वायरस का उत्पादन कर सकते हैं कि एक सेल लाइन बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. बिल्कुल के रूप में वर्णित पारगमन और अभिकर्मक चरणों का प्रदर्शन इस तरह के एक क्लोन पैदा करने की संभावना को अधिकतम जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम स्थिरतापूर्वक नियामक प्रणाली बंद टीईटी के तहत सभी lentiviral घटकों के साथ transduced 293T कोशिकाओं का उपयोग lentiviral वैक्टर की बड़ी मात्रा में उत्पादन के लिए एक विधि को रेखांकित किया है. तिथि करने के लिए, lentiviral वैक्ट?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पांडुलिपि के लिए डेटा योगदान के लिए माइकल चाउ, Bingbing दाई, और लियांग जिओ स्वीकार करना चाहते हैं. हम भी इस अध्ययन में इस्तेमाल अभिकर्मकों के उदार उपहार के लिए डॉ. जॉन ग्रे को स्वीकार करते हैं. पंजाब नेशनल कैंसर केंद्र से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है. इस शोध के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01AI68978, P01CA132681 और RCA170820A), बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन, translational चिकित्सा के लिए संयुक्त केंद्र से एक translational त्वरण अनुदान और कैलिफोर्निया एचआईवी / एड्स से अनुदान से अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया रिसर्च प्रोग्राम.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
Referenzen
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
