Stereotaktisk Mikroinjektion af virale vektorer, der udtrykker Cre recombinase at undersøge den rolle, målgener i Kokain Konditioneret Place Preference

Kokain er et stærkt forstærkende psykostimulerende. Efter gentagen eksponering, forekomme flere molekylære og cellulære tilpasninger i belønning-relevant hjernen kredsløb, der menes at resultere i kompulsiv narkotika-søger adfærd, hvilket fik høje tilbagefald, der udgør et alvorligt klinisk problem ^1.. Kokain udøver disse langvarige adfærdsmæssige effekter ved regulering af genekspression. At studere de tilpasninger, der opstår fra kronisk brug af kokain, har prækliniske gnavermodeller været brugt i udstrakt. En sådan model er den betingede sted præference (CPP) paradigme. Denne model indebærer udvikling af en lært forening mellem en tidligere neutralt miljø og givende egenskaber kokain. Efter flere fodboldmesterskaber af kokain med en bestemt kammer er dyr lov til frit at udforske kokain-parret og har non-kokain-parret miljøer, og hvis de foretrækker narkotika parrede rum, er de siges at have erhvervet en kokain-induceret place præference. Desuden efter en udslettelse træningsperiode, kan dette paradigme bruges til at studere kontekst-specifikke genindsættelse af kokain-søger adfærd.

Sammenlignet med andre adfærdsmæssige modeller af vanedannende-lignende adfærd, såsom psykomotorisk sensibilisering, som bruges til at studere langsigtet kokain-induceret adfærdsmæssige og molekylær plasticitet ^2,3 og selvadministration (SA), der menes at mere præcist efterligne vanedannende -lignende adfærd hos mennesker, er CPP paradigme en enkel procedure til at studere kokain kontekstuelle læring ^4.. CPP protokoller kan bekvemt udvides til at omfatte udryddelse og genindsættelse faser ligeledes til SA, som giver mulighed for undersøgelse af de underliggende mekanismer narkotika trang og tilbagefald ^5-7 og som menes at rekapitulere aspekter af, hvad der sker i humant lægemiddel-søgende adfærd og narkotika – og cue-induceret tilbagefald ^8-10.

En mekanisme, der ligger til grund forkokain-induceret adfærdsmæssige plasticitet, der er karakteristisk for hver af de forskellige faser af CPP, herunder erhvervelse, udryddelse, og genindsættelse, er aktivering af unikke signaturer genekspression inden for forskellige områder af hjernen. Til direkte teste, hvilke gener inden belønning-relevante områder af hjernen medierer kokain-induceret adfærdsmæssige ændringer, er det nyttigt at være i stand til at manipulere dem selektivt i et regionalt-specifik måde. En måde at opnå dette på er at microinject rekombinante adenoassociated viral (rAAV)-vektorer, der udtrykker Cre-rekombinase med stereotaktisk kirurgi, i særskilte områder i hjernen af ​​mus, der har målgener flankeret af loxP sites (floxet mus). Denne metode giver mulighed for meget præcis tidsmæssig og regional kontrol over, hvornår og hvor generne er poleres, i både delende og ikke-delende neuroner, uden at inducere immunresponser ^11-13. Dette niveau af kontrol er en vigtig fordel i forhold til traditionelle Cre-LoxP teknologi af ynglende floxet mus wed mus, der udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af et endogent gen promotor, idet timingen og fordelingen af ​​gendeletion kan mere stramt reguleret. Derudover viral vektor-medieret gen knockout omgår potentielle udviklingsmæssige kompenserende virkninger, der kan opstå ved brug af traditionelle knockout strategier.

Foruden kokain CPP, som er beskrevet her, mikroinjektion af rAAV-Cre ind i hjernen på mus floxet at vurdere betydningen af ​​specifikke gener kan anvendes ubikvitært til adfærdsmæssige paradigmer, der involverer separate faser, herunder selvadministration og psykomotorisk sensibilisering. For eksempel har vores laboratorium udnyttet rAAV-Cre teknologi at undersøge den rolle, Ca _{V 1.2} L-type ^{Ca2 +-kanaler} i kokain psykomotorisk sensibilisering ^14. Specifikt blev rAAV-Cre mikroinjiceres i nucleus accumbens (NAC) i mus med genet, som koder Ca _v 1.2 floxet at påvise, at Ca _v </sub> 1.2 handler i denne region medierer ekspressionen fase af psykomotorisk sensibilisering ^14,15. Dog kan rAAV-Cre strategi ikke anvendes, hvis mus med en floxet gen af interesse ikke eksisterer, som var vores erfaring, når vurderingen rolle Ca _{V 1.3} L-type ^{Ca2 +-kanaler} i psykomotorisk sensibilisering. Dermed en begrænsning af anvendelse rAAV-Cre præsenterer sig selv hvis betingede mus, ikke eksisterer for et bestemt gen af ​​interesse. Men rAAVs der udtrykker siRNA kan bruges til at Knockdown target gener, som vi har gjort for at undersøge, hvilken rolle Ca _{V 1.3} kanaler ^14,15.

Mikroinjektion rAAV-Cre i adskilte områder af hjernen i floxet mus og derefter teste dem i CPP paradigme tillader undersøgelse af de specifikke gener, der medierer de forskellige faser af vanedannende-lignende adfærd, og hvor de handler. Brug af dette paradigme har hjulpet i vores forståelse af, hvordan gentagen kokain administration i det væsentlige hijacks brains belønning kredsløb forårsager utilpasset forandringer i molekylær signaltransduktionsveje og genekspression, der fører til den afhængige tilstand ^1,16,17.