Характеристика воспалительных реакций во время интраназальной колонизации стрептококковой пневмонией
Summary
Описана колонизация муринной носоглотки со стрептококковой пневмонией и последующая экстракция адептичных или завербованных клеток. Этот метод включает в себя промывку носоглотки и сбор жидкости через nares и адаптируется для различных считываний, в том числе дифференциальной количественной оценки клеток и анализа экспрессии мРНК на месте.
Abstract
Колонизация носоглотки стрептококковой пневмонией является необходимым условием для вторжения в легкие или кровоток1. Этот организм способен колонизировать слизистую поверхность носоглотки, где он может находиться, размножаться и в конечном итоге преодолевать защитные силы хозяина, чтобы вторгнуться в другие ткани хозяина. Установление инфекции в обычно нижних дыхательных путях приводит к пневмонии. Кроме того, бактерии могут распространяться в кровоток, вызывая бактериемию, которая связана свысоким уровнем смертности 2, или же привести непосредственно к развитию пневмококкового менингита. Понимание кинетики и иммунной реакции на колонизацию носоглотки является важным аспектом моделей инфекции S. pneumoniae.
Наша модель мыши интраназальной колонизации адаптирована изчеловеческих моделей 3 и была использована несколькими исследовательскими группами в изучении реакций хозяина-патогена в носоглотку4-7. В первой части модели мы используем клинический изолят S. pneumoniae для создания самоограничения бактериальной колонизации, которая похожа на перевозки событий у взрослых людей. Процедура, подробно описанная в настоящем, включает в себя подготовку бактериального инокулума, а затем создание события колонизации путем доставки инокулума через интраназальный маршрут введения. Резидентные макрофаги являются преобладающим типом клеток в носоглотки во время устойчивого состояния. Как правило, Есть несколько лимфоцитов, присутствующих в неинфицированныхмышей 8, однако слизистой колонизации приведет к низкой до высококачественной воспаления (в зависимости от вирулентности бактериальных видов и штаммов), что приведет к иммунной реакции и последующего набора иммунных клеток хозяина. Эти клетки могут быть изолированы от лаваж содержимого трахеи через nares, и коррелирует с плотностью бактерий колонизации, чтобы лучше понять кинетику инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы представили подробные методы интраназальной колонизации мышей с использованием клинического изолятного штамма стрептококковой пневмонии и последующей изоляции и характеристики иммунных клеток, набранных в носоглотку в ответ на бактерии. Мы продемонстри?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Джеффри Вайзер из Университета Пенсильвании за его дар клинических штаммов стрептококковой пневмонии. Эта работа финансировалась Канадскими институтами исследований в области здравоохранения. CV финансировался стипендией M. G. DeGroote и стипендией Канадского торакального общества. Эта работа финансировалась Ассоциацией легких Онтарио и Канадскими институтами медицинских исследований (CIHR). Работа в лаборатории Боудиш частично поддерживается он Майкл Г. DeGroote Центр исследований инфекционных заболеваний и McMaster иммунологический исследовательский центр.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Anti-Mouse Ly6C FITC | BD Pharmingen | 553104 | |
| Anti-Mouse Ly6G PE | BD Pharmingen | ||
| Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 | eBioscience | 48-0453-82 | |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen APC | eBioscience | 17-4801-82 | |
| Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 | eBioscience | 25-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0032-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC | eBioscience | 93-0041-42 | |
| Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| BD 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD 26G3/8 Intradermal Bevel | Becton Dickinson | 305110 | |
| Buffer RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton Dickinson | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | PML Microbiologicals | A0404 | |
| RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0253L | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 |
Referenzen
- Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
- Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
- van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
- Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
- Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
- McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
- Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
- Wu, H. -. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
- Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
- Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
- Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Bryant, W. P., J, , et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
- Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
- Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
- Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
- Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
- Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
- Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
- Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
- Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
