Menschen neuroprogenitor Zellen (NPCs) wurden unter proliferierenden Bedingungen erweitert. NSC wurden in Neuron-reiche Kulturen in der Gegenwart einer Kombination von Neurotrophinen unterscheiden. Neuronale Marker wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Um eine reine Population von Nervenzellen zu isolieren, wurden NPCs auf PEN-Membran-Folien differenziert und Laser-Mikrodissektion durchgeführt wurde.
Neuroprogenitor Zellen (NPC) von der menschlichen fötalen Gehirn isoliert wurden unter proliferativen Bedingungen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), um eine reichliche Zufuhr von Zellen bereitzustellen erweitert. NSC in Gegenwart einer neuen Kombination von Nervenwachstumsfaktor (NGF) differenziert, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Dibutyryl-cAMP (DBC) und Retinsäure auf mit Poly-L-Lysin-und Maus-Laminin beschichteten Platten zu erhalten Neuron reichen Kulturen. NPCs wurden auch in der Abwesenheit von Neurotrophine, DBC und Retinsäure und in Gegenwart von ciliary neurotrophic factor (CNTF) zu Astrozyten-reichen Kulturen ergeben differenziert. Differenzierte NPCs wurden durch Immunfluoreszenzfärbung für ein Panel von neuronalen Marker NeuN einschließlich, Synapsin, Acetylcholinesterase, Synaptophysin und GAP43 gekennzeichnet. Saure Gliafaserprotein (GFAP) und STAT3, Astrozyten-Marker wurden in 10-15% der differenzierten NPCs erkannt. Zur ErleichterungZelltyp-spezifische molekulare Charakterisierung wurde die Laser Mikrodissektion durchgeführt, um Neuronen auf Polyethylennaphthalat (PEN)-Membran gleitet kultiviert isolieren. Die in dieser Studie beschriebenen Methoden liefern wertvolle Werkzeuge, um unser Verständnis der molekularen Mechanismen der Neurodegeneration zu fördern.
Lebenslange Neurogenese ist bekannt, in der Subventrikularzone der Seitenventrikel und der subgranulären Schicht des Gyrus dentatus des erwachsenen Gehirns von Säugetieren 1 auftreten. Neuroprogenitor Zellen (NPCs), die aus diesen Regionen stammen, sind multipotente Zellen, die in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten 2 differenzieren können. NSC haben Interesse, weil ihr Potential bei Patienten mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD) 3 transplantiert werden erzeugt. Studien mit NPCs haben in der Regel auf dieser Transplantation Winkel konzentriert, aber das Potential der NPC-abgeleiteten Neuronen als Zellkultur-Modell, um den Mechanismus der Neurodegeneration zu bestimmen, ist noch nicht vollständig ausgenutzt. Frühere Studien haben in der Regel verwendet, post-mitotischen Neuronen aus Nager-Hirngewebe, die für jedes Experiment isoliert werden müssen, da sie nicht isoliert sindSelbsterneuerung. Obwohl humane Neuroblastom-Zelllinien, einschließlich SH-SY5Y-und SK-N-MC-Zellen erweitert werden kann, haben sie nicht die Eigenschaften der primären Neuronen. Menschliche NSC, andererseits bieten sowohl Vorteile, da sie für mehrfache Durchgänge erweitert werden und differenziert werden, um eine Zellpopulation mit den Merkmalen des primären Neuronen 4,5 zu erzeugen. In der aktuellen Studie beschreiben wir eine neue Differenzierungsprotokoll, um eine konsistente Neuron-reichen Bevölkerung aus kommerziell erhältlichen NPCs aus menschlichen fetalen Gehirns isoliert zu erhalten. Da diese Kulturen haben einen kleinen Prozentsatz von Gliazellen enthalten, brauchen wir zusätzliche Methoden, um eine reine Population von Neuronen zur molekularen Charakterisierung isolieren. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ist eine neuartige Technik, mit der eine homogene Population von Zellen aus einem Gewebeschnitt selektiv zur Genexpressionsanalyse 6 erfasst werden. Das Gehirn ist ein heterogenes Gewebe, bestehend aus Neuronen, Glia und anderen Zell types. LCM wurde verwendet, um Neuronen-spezifische Genexpression zu bestimmen, analysiert 7-10. Wir haben schon früher durchgeführt LCM von Neuronen im Hippocampus von AD (Tg2576) Maushirnschnitten zu einer verminderten Expression des zyklischen AMP-Response-Element-bindendes Protein (CREB) und BDNF spezifisch in Neuronen im Hippocampus 11 zeigen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir Verfahren für die Erweiterung der menschlichen NPCs, neuronale Differenzierung, Immunfluoreszenzfärbung für neuronale Marker und LCM für die Isolierung von Neuronen auf PEN-Membran-Folien kultiviert.
Wir beschreiben in dieser Studie ein Neuron-reichen Zellkulturmodell durch die Differenzierung von selbst erneuernden menschlichen neuroprogenitor Zellen und eine Methode, um eine reine Population von Neuronen durch Laser-Mikrodissektion isolieren. Wir haben eine Kombination von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure für die neuronale Differenzierung von NPCs verwendet. DBC wird zur CREB, ein Transkriptionsfaktor, der Neurogenese 12 verbessert aktivieren. Retinsäure induziert Zellzyklusaustritt und reduziert die Gl…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von Merit Bewertung Zuschuss (NEUD-004-07F) von der Veterans Administration (SP) unterstützt.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
Research Laboratories | |||
Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
Research Laboratories | |||
BSA | Sigma | A1653 | |
Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |