Использование<em> В естественных условиях</em> Изображений для мониторинга прогрессирования Экспериментальная цитомегаловирусной инфекции у новорожденных мыши
Summary
Цитомегаловирус человека (ЦМВ) инфекции новорожденных представляет собой важный причиной умственной отсталости, но молекулярные события, приведшие к индуцированной вирусом патогенеза остаются малоизученными. Для исследования динамики мозговой инфекции, мы адаптировали целого животного<em> В естественных условиях</em> Визуализации для выполнения длительных Конечно анализ новорожденных инфицированы люциферазой рекомбинантный вирус.
Abstract
Цитомегаловирус человека (ЦМВ или ВГЧ-5) является опасным для жизни возбудителя в ослабленным иммунитетом лиц. При врожденной или неонатальной инфекции, вирус может заразить и размножаться в развивающемся мозге, которые могут вызывать серьезные неврологические нарушения, вплоть до глухоты и умственной отсталости. Несмотря на потенциальную тяжесть симптомов, терапевтические возможности ограничены отсутствием вакцины и отсутствие конкретного противовирусной терапии. Кроме того, точное описание молекулярных событий, происходящих во время инфекции центральной нервной системы (ЦНС) до сих пор отсутствует, так как наблюдения основном вытекают из вскрытия инфицированных детей. Нескольких животных моделях, таких как макаки резус CMV, были разработаны и стал важным вкладом в патогенезе ЦМВ в ЦНС. Однако, несмотря на эволюционную близость с людьми, эта модель была ограничена внутричерепного процедуру прививки использовали для инфицирования животных и минусыistently вызывают инфекции ЦНС. Кроме того, этические соображения способствовали разработке альтернативных моделей, среди которых неонатальной инфекции новорожденных мышей с мышью цитомегаловирус (MCMV) в последнее время привело к значительному прогрессу. Например, сообщалось, что внутрибрюшинной инъекции MCMV к линии BALB / C новорожденных приводит к инфекции нейроны и глиальные клетки в определенных областях головного мозга. Эти результаты говорят о том, что экспериментальные прививки мышей может резюмировать дефицита индуцированные ЦМВ инфекции у детей. Тем не менее, динамический анализ MCMV инфекции новорожденных трудно выполнить, потому что классическая методология требует жертву значительное количество животных в различные моменты времени для анализа вирусной нагрузки и / или связанных с иммунитетом параметров. Чтобы обойти это узкое и дать возможность дальнейших исследований редких мутантных животных, мы использовали в естественных изображений технология для выполнения временной ход анализа вирал распространение в мозге после инъекции периферийных рекомбинантного MCMV выражения люциферазы в C57BL / 6 новорожденных.
Introduction
Цитомегаловируса человека (HCMV/HHV-5) является членом β-герпесвирусов семьи. ЦМВ является весьма распространенной, условно-патогенным микроорганизмом, который обычно приобретенные в раннем возрасте так и в бессимптомной 1. Как и все вирусы герпеса, ЦМВ сохраняется в течение всей жизни хозяина, чья иммунная система жестко контролирует репликацию вируса. Эпизоды реактивации вирусов в основном происходят у ослабленных лиц, таких как пересадка пациентов, получающих препараты для предотвращения отторжения трансплантата 2. У взрослых HCMV также была связана с глиобластомы 3. Кроме того, ЦМВ является известный патоген для новорожденных с незрелым иммунитетом 4-6. Первичная инфекция у развивающегося плода или новорожденного может иметь серьезные последствия. ЦМВ инфекция является наиболее распространенной инфекционной причиной врожденных дефектов рождения и детских расстройств в развитых странах. Считается, что частота неонатальной инфекции ЦМВ влияет на 0,5-1% OF всех живорожденных среди которых 5-10% будут страдать от тяжелых симптомов, таких как микроцефалия или гипоплазии мозжечка. Кроме того, 10% ВИЧ-инфицированных детей с субклинической вирусная инфекция будет развиваться позже sequellae ведущие к умственной отсталости, потеря слуха, дефекты зрения или захват и эпилепсии 7,8.
В отличие от других человеческих вирусов герпеса, таких как простого герпеса 1 (HSV-1/HHV-1), которые могут быть привиты на мышах по различным маршрутам впрыска 9, цитомегаловирус репликации конкретных видов. Эта особенность сильно затруднено исследований патогенеза HCMV, которые выполняются в различных моделях на животных (мыши, крысы, морской свинки, макака-резуса) и их соответствующие подлинной узла-CMVs. Все CMVs проявляют значительное сходство в размерах генома и организации, тропизм к тканям и регуляции экспрессии генов. Они также вызывают такой же патологии в принимающих их стран. Несмотря геномного разнообразия бытьмежду HCMV и мышь цитомегаловирус (MCMV) (50% от ORF, присутствующих в человеческий вирус определены в мышиной CMV), мышиной модели недавно доказал, что предпочтительно, в основном потому, что мутантные штаммы могут быть протестированы на их способность контролировать вирусную Репликация в естественных условиях. Это привело к генетической экран, который включен оценки количества генов мыши, высказанные на взрослой стадии, которые составляют "resistome" этого вируса 10. В целом, это означает, что MCMV-инфицированных мышей представляют собой привлекательную модель для изучения хост-вирус взаимодействия у взрослых. Разведка врожденной инфекции CMV является более сложным, так как различия в плацентарных организации слой между человеком и мышей ухудшают матери к плоду передачи вирусной инфекции у мышей. В последнее время непосредственного впрыска MCMV в плаценте в день 12,5 беременности позволило инфекции мозга новорожденных мышей, которые привели к нарушением слуха 11. Однако, большинство яnvestigations теперь использовать внутрибрюшинного введения 4-20 HR-старые новорожденных обеспечить системное вирусное распространение потенциально ведет к гематогенной инфекции мозга, модель, которая является более актуальным, чем внутричерепные инъекции. Этот протокол важным вкладом в патогенезе CMV и, в частности, было показано, что MCMV инфекции результатов новорожденных в репликации вируса в нейрональных и глиальных клеток, расположенных в воспалительных очагов, которые проникли с мононуклеарными клетками, как макрофагами 12. В этом докладе также описан изменены морфогенез мозжечка сопровождается снижением гранулированный пролиферацию и миграцию нейронов и индукции нескольких интерферон-стимулированных генов. Существенную роль CD8 + Т-клеток для контроля MCMV в центральной нервной системе также сообщалось той же группой 13. Важным аспектом, который следует учитывать при анализе патологического эффекта микроб динамики заражаютиона. В случае MCMV, это особенно важно для изучения и количественной оценки прогрессирования вирусного распространение в развивающемся мозге, чтобы понять и предвидеть величину будущих нейробиологическое травм. Традиционно, количественное прогрессирование инфекции требуется регулярное жертву инфицированных животных титра возбудителя в тканях, таких как мозг, которые в противном случае недоступны. Этот тип протокола теперь оспорены необходимым улучшение благополучия животных и 3Rs (Сокращение, уточнить, заменить) принципы 14. Использование в естественных условиях технологии визуализации может позволить резкое сокращение числа животных, которые необходимы в естественных условиях эксперименты инфекции. Здесь мы приводим и описывают временной ход анализа вирусной распространение в мозге после внутрибрюшинного MCMV-Luc инъекции мышь новорожденных. Используя ту же самую животных, мы отслеживать и контролировать в естественных местах интенсивного VIRAL репликации во время 2-недельного периода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование технологии в естественных изображений для мониторинга MCMV-Люк распространение в новорожденных мышей, мы смогли наблюдать распространение вируса в мозг мутантных животных, в отличие от дикого типа. Далее вскрытие животного и бывший естественных изображений моз…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ли Tuddenham (IBMC, Страсбург) для усиления и титрования MCMV-Люк и Томас Baumert (INSERM U748, Страсбург) за разрешение использовать вивария Института вирусологии. Финансовая поддержка со стороны INSERM, Университет Страсбурга и Национальное агентство La Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) признается. Первоначальная участием Соня Beroud и Летиция Lelieur во время их главный проект также признается.
Materials
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Referenzen
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy?. Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. Immunity in neonates. Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. Immune responsiveness in the neonatal period. J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
