Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.
De longo prazo da deficiência cognitiva após TCE está associada com lesão induzida neurodegeneração na região do hipocampo, uma no lobo temporal medial, que é fundamental para a aprendizagem, memória e função executiva. 1,2 Daí nossos estudos se concentrar na análise de expressão gênica de neuronal específica populações em sub-regiões distintas do hipocampo. A técnica de captura de laser microdissecção (LCM), introduzido em 1996 por Emmert-Buck et al., 3 permitiu avanços significativos em análises de expressão de genes de células individuais e as populações de células enriquecidas a partir de tecidos heterogéneos, como o cérebro dos mamíferos que contém milhares de tipos de células funcionais. 4 Usamos LCM e um modelo de rato bem estabelecido de lesão cerebral traumática (TCE) para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patogênese do TCE. Seguindo fluido percussão-TBI, os cérebros são removidos em tempos pré-determinados após a lesão, imediatamente congeladas em gelo seco,e preparados para seccionamento num criostato. Os cérebros de rato pode ser incorporado em OCT e seccionados imediatamente ou armazenados durante vários meses à temperatura de -80 ° C, antes de seccionamento por microdissecção captura laser. Adicionalmente, nós utilizamos LCM para estudar os efeitos do TCE sobre os ritmos circadianos. Para isso, vamos capturar os neurônios do núcleo supraquiasmático que contêm o relógio mestre do cérebro de mamíferos. Aqui, demonstramos a utilização de LCM para obter neurónios individuais identificados (lesionado e degeneração, Fluoro-Jade-positivo, ou não lesionado, Fluoro-Jade-negativa) e as populações enriquecidas de neurónios do hipocampo para subsequente análise da expressão do gene por PCR em tempo real e / ou todo genoma microarrays. Estes estudos LCM habilitados têm revelado que a vulnerabilidade selectiva de regiões anatomicamente distintos do hipocampo do rato são reflectidos nos perfis de expressão de genes diferentes de diferentes populações de neurónios obtidos por LCM destas regiões distintas. Os resultados dos nossos estudos de célula única, quandoComparando os perfis de transcrição de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo, sugerindo a existência de um reostato sobrevivência da célula que regula a morte celular e sobrevivência após TBI.
A análise da expressão do gene de tecidos heterogéneos tem sido problemático,. Isto é particularmente verdadeiro no cérebro dos mamíferos, que possui cerca de 5.000 tipos de células diferentes de 4 Antes do desenvolvimento da microdissecação de captura laser (LCM), a técnica, os estudos genômicos dos efeitos da TBI in vivo foram baseadas na análise da expressão de genes de uma população mista de células cerebrais compreendidos, não só de diferentes tipos de células neuronais, mas também de células gliais de apoio e imunomoduladores. Os perfis de expressão resultantes complexos de genes obtidos a partir desses tecidos heterogéneos e os padrões frequentemente contraditórios de lesões induzidas por sinais celulares, pode ser uma explicação para a falha em ensaios clínicos humanos de estratégias terapêuticas mostrado eficaz em estudos pré-clínicos de TBI 5.
Para se obter uma compreensão clara da lesão induzida pela expressão do gene em populações vulneráveis de neurónios de rato a partir do quadrilpocampus, foi adotada a técnica de LCM, pela primeira vez por et al Emmert-Buck. 3 Posteriormente, modificado e aperfeiçoado esta técnica de microdissecção para captura eficiente de populações enriquecidas de neurônios e neurônios individuais para perfis mRNA usando quantitativa PCR em tempo real e análise de microarray . Para manter a integridade do mRNA em secções congeladas de tecido cerebral de análise genómica, modificamos protocolos existentes para a fixação, a coloração e captura rápida de neurónios de secções de cérebro de rato congelados. Para identificação e isolamento de feridos e moribundos neurônios do hipocampo, também otimizou a técnica de coloração Fluoro Jade-para LCM. Fluoro-Jade não faz distinção entre a morte celular por apoptose e necrose. Assim, todos os tipos de neurónios em degeneração pode ser detectada por esta mancha 6,7.
Aqui, descrevemos o protocolo utilizado em nosso laboratório para obter piscinas de neurônios morrem ou sobrevivem, assim como trechos de enriquecido populatiComplementos de diferentes tipos de células neuronais (ou seja, CA1-CA3 neurônios para análise de expressão gênica após TCE). O procedimento para a lesão de percussão fluido cérebro realizado no nosso laboratório é descrito em detalhe em Shimamura et al., 8 e é muito semelhante ao protocolo de lesão de percussão lateral do fluido, em ratos publicadas em JoVE por Alder et al. 9 Uma vez que a técnica tem LCM mostrado ter um efeito mínimo ou nulo sobre a integridade do DNA, RNA e proteínas nos tecidos, esta é uma excelente ferramenta para a análise molecular da proteína e de tipos de células definidas.
Esta técnica LCM nos permitiu fazer avanços significativos na compreensão dos mecanismos moleculares de TCE. 8,10,11,12,13 Fomos os primeiros a utilizar esta técnica para demonstrar que as sub-regiões distintas do hipocampo de ratos têm perfis de expressão de genes que correlacionam-se com a sua vulnerabilidade selectiva de lesões. Nossos estudos mostraram que podemos quantificar a expressão de genes, por qPCR, de apenas 10 células de laser capturados e que poderíamos realizar genoma análise de microarranjo de tão poucos como 600 células capturadas. LCM seria uma ferramenta útil em estudos semelhantes de outras regiões do cérebro que se sabe estarem implicados em diversos distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos. Por exemplo, estudos utilizando LCM lançaram luz na patogênese da doença de Parkinson em neurônios dopaminérgicos da substância negra, 14 e ajudado estudos do genoma de perfil de núcleo accumbens, que está envolvida em circuitos de recompensa implicados no substance desordens de abuso. 15
Heterogeneidade neuronal é reflectida ao nível do genoma e 16 podem contribuir para a falta de sucesso dos tratamentos experimentais para o TCE em ensaios clínicos. Assim, o nosso objetivo é utilizar essa técnica para investigar os elementos críticos que influenciam a sobrevivência neuronal após o TCE. O nosso estudo profiling recente do genoma de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo após TBI sugerido que um reostato celular que reflecte a proporção dos níveis de expressão de genes para a sobrevivência das células de morte celular regula o destino da célula após TBI. Estes estudos em curso vai contribuir para a concepção e desenvolvimento de estratégias farmacoterapêuticas que podem influenciar positivamente o reostato sobrevivência celular. Além disso, usamos atualmente LCM para rastrear e monitorar os efeitos de potenciais tratamentos com drogas terapêuticas em neurônios do hipocampo após TCE. Assim, nossos estudos demonstram que dadas cuidadosas técnicas de RNase de manipulação e algunsmodificações dos protocolos existentes, é possível a obtenção de amostras de ARN de alta qualidade a partir de LCM para análise quantitativa de expressão génica precisas.
No entanto, existem algumas armadilhas associados a técnicas de LCM. Por exemplo, a recolha de apenas células neuronais sem qualquer contaminação microglia pode ser quase impossível. Na camada de células piramidais do hipocampo foi estimado que 95% das células são neurónios, com 90% desta população de células piramidais ser e interneurônios 10%, deixando uma pequena percentagem de tipos de células da glia e outros. 8,17, 18 Em nossos estudos, utilizamos Fluoro-jade um corante fluorescente que, especificamente, somente etiquetas neurônios lesados no tecido cerebral. Uma mancha diferente que é um marcador para a GFAP seria necessária para corar microglia 19. Recolha apenas as Fluoro-jade coradas individuais corpos neuronais assegura uma população mais homogénea de neurónios. Outro problema comum que pode exigir a resolução de problemas é um círculo que hát definido quando o laser é disparado. Se isto ocorre, é necessário controlar os ajustes do laser e ajustar a potência e duração, conforme necessário. Também é importante para garantir que a tampa é colocada sobre o tecido liso e assentado corretamente no braço. Consultando o manual da LCM técnico ou ligar para o suporte técnico, por vezes, ser necessário. Seguindo LCM e isolamento de ARN, a qualidade do RNA devem sempre ser avaliada utilizando um Bioanalyzer antes de qualquer análise da expressão do gene.
Existem vários tipos de instrumentos de captura a laser atualmente no mercado, incluindo o corte a laser (Life Technologies, Leica Microsystems) e laser catapultando (Zeiss) instrumentos. O nosso sistema LCM funciona bem para a captura de pequenos números de células. Outros sistemas de alto rendimento e mais automatizado pode ser mais adequada para a obtenção de um maior número de células para a análise genómica e proteómica particularmente. Na verdade, LCM usando esses sistemas automatizados tem um grande potencial para a análise de protein expressão em células identificadas ou populações enriquecidas de células. 20 Além disso, LCM podem facilitar a análise de expressão de genes de células immunolabeled, 21, permitindo-nos a investigar a expressão de genes em tipos de células definidas independentemente da complexidade nos tecidos mais heterogéneos. Assim, LCM é uma excelente ferramenta para a ponta estudos moleculares de populações simples ou enriquecido de células.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é financiado por R01 NS052532 (para HLH), a Fundação Moody, e do Departamento de Anestesiologia. Agradecemos Laurie Bolding, Christine Courteau Butler e Christy Perry para a sua assistência editorial, e Christy Perry para layout e excelente produção de todas as figuras, tabelas e ilustrações.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |