Vi beskriver hur du använder mikrodissektion laser capture (LCM) för att erhålla anrikade populationer av hippocampus neuroner eller enskilda neuroner från frysta avsnitt i skadade råtthjärna för efterföljande genuttryck analys med kvantitativ realtids PCR och / eller hel-genomet microarrays.
Långsiktig kognitiva funktionshinder efter TBI är associerade med skador-inducerad neurodegeneration i hippocampus-en region i den mediala tinningloben som är avgörande för inlärning, minne och exekutiva funktioner. 1,2 Därav våra studier fokuserar på genuttryck analys av specifika neuronala populationer i distinkta subregioner av hippocampus. Tekniken med laser capture mikrodissektion (LCM), som infördes 1996 av Emmert-Buck, et al. 3 har möjliggjort för betydande framsteg i genuttryck analys av enskilda celler och berikade populationer av celler från heterogena vävnader såsom däggdjurshjärnan som innehåller tusentals funktionella celltyper. 4 Vi använder LCM och en väl etablerad råttmodell av traumatisk hjärnskada (TBI) för att undersöka de molekylära mekanismerna som ligger bakom patogenesen av TBI. Efter vätske-slagverk TBI är hjärnor avlägsnas vid förutbestämda tidpunkter efter skada, omedelbart fryses på torris,och bereddes för sektionering i en kryostat. De råtthjärnor kan bäddas in i oktober och snittades omedelbart eller lagras flera månader vid -80 ° C innan snittning för laser fånga mikrodissektion. Dessutom använder vi LCM att studera effekterna av TBI på dygnsrytmen. För detta, fånga vi neuroner från suprachiasmatiska kärnor som innehåller huvudklockan av däggdjurshjärnan. Här visar vi att använda LCM för att erhålla enstaka identifierade nervceller (skadade och degenererade, fluor-Jade-positiva, eller oskadade, fluor-Jade-negativ) och berikade populationer av hippocampus nervceller för efterföljande genuttryck analys av realtids PCR och / eller hel-genomet microarrays. Dessa LCM-aktiverade studier har visat att den selektiva sårbarhet anatomiskt distinkta regioner i råtthippocampus återspeglas i de olika genuttrycksprofilerna olika populationer av nervceller som erhållits av LCM från dessa olika områden. Resultaten från våra encelliga studier, därvi jämför de transkriptionella profiler döende och angränsande överlevande hippocampala neuroner, tyder på förekomsten av en cellöverlevnad reostat som reglerar celldöd och överlevnad efter TBI.
Genuttrycksanalys av heterogena vävnader har alltid varit problematiskt,. Detta gäller särskilt i däggdjurshjärnan, som har cirka 5.000 olika celltyper 4 Före utvecklingen av lasern fånga mikrodissektion (LCM) teknik, genomiska studier av effekterna av TBI in vivo var baserade på analys av genuttryck i en blandad population av hjärnan består celler, inte bara av olika neuronala celltyper, men också att stödja gliaceller och immunmodulerande celler. De resulterande komplexa genuttryck profiler som erhållits från dessa heterogena vävnader, och de ofta motstridiga mönster av skador-inducerade cellulära signaler, kan vara en förklaring till misslyckandet i humana kliniska prövningar av terapeutiska strategier visat sig effektiv i prekliniska studier av TBI. 5
För att få en tydlig förståelse av skada-inducerad genuttryck i utsatta populationer av nervceller från råtta höftenpocampus antog vi tekniken av LCM, först rapporterades av Emmert-Buck et al. 3 Därefter vi ändrade och optimerade denna mikrodissektion teknik för effektiv insamling av berikade populationer av nervceller och enskilda neuroner för mRNA-profilering med kvantitativ realtids PCR och microarray analys . För att bibehålla integriteten hos mRNA i frusna sektioner av hjärnvävnad för genomisk analys, modifierade vi befintliga protokoll för fixering, färgning och snabb infångning av neuroner från frysta sektioner råtthjärna. För identifiering och isolering av skadade och döende hippocampus nervceller, optimerat vi också fluor-Jade färgning teknik för LCM. Fluor-Jade skiljer inte mellan apoptotisk och nekrotisk celldöd. Sålunda, kan alla typer av degenererande neuroner kan detekteras genom denna fläck. 6,7
Här beskriver vi det protokoll som används i vårt laboratorium för att få pooler av enstaka döende eller efterlevande neuroner samt stråk av anrikad populations av distinkta neuronala celltyper (dvs. CA1-CA3 neuroner för genuttrycksanalys efter TBI). Förfarandet för flytande slagverk hjärnskada utförs i vårt laboratorium beskrivs i detalj i Shimamura et al. 8 och är mycket lik den laterala fluid slagverk skada protokoll för möss publicerade i JUPITER av Alder et al. Eftersom LCM tekniken har 9 visats ha minimal eller ingen effekt på integriteten av DNA, RNA och protein i vävnader, är detta ett utmärkt verktyg för molekylär och proteinanalys av definierade celltyper.
Denna LCM teknik har gjort det möjligt för oss att göra betydande framsteg i att förstå de molekylära mekanismer TBI. 8,10,11,12,13 Vi var de första utredarna att utnyttja denna teknik för att visa att olika delområden av råtthippocampus har genuttrycksprofilerna som korrelera med deras selektiva känslighet för skada. Våra studier visade att vi kunde mäta genuttryck, av qPCR från så lite som 10 fångade laser celler och att vi kunde utföra genomet hela microarray analys från så få som 600 fångade celler. LCM skulle vara ett värdefullt verktyg i liknande studier av andra delar av hjärnan som är kända för att vara inblandade i olika neurologiska och neuropsykiatriska sjukdomar. Till exempel har studier med LCM belysa i patogenesen av Parkinsons sjukdom i dopaminneuroner i substantia nigra, 14 och understödda genomet hela profilering studier av nucleus accumbens, som är involverat i belöning kretsar inblandade i substance missbruk störningar. 15
Neuronal heterogenitet återspeglas på genomnivå 16 och kan bidra till den bristande framgången för experimentella behandlingar för TBI i kliniska prövningar. Således är vårt mål att utnyttja denna teknik för att undersöka de kritiska delarna påverkar neuronal överlevnad efter TBI. Vår senaste genomet hela profilering studie av döende och angränsande överlevande hippocampala neuroner efter TBI föreslog att en cellulär reostat som återspeglar förhållandet mellan expressionsnivåema av cellöverlevnad till gener celldöd reglerar cellens öde efter TBI. Dessa pågående studier kommer att bidra till utformningen och utvecklingen av farmakoterapeutiska strategier som positivt kan påverka reostat cellöverlevnad. Dessutom använder vi nu LCM att spåra och övervaka effekterna av potentiella terapeutiska läkemedelsbehandlingar i hippocampus nervceller efter TBI. Således våra studier visar att grundligt RNas-fria hanteringstekniker och någramodifieringar av befintliga protokoll, är det möjligt att erhålla högkvalitativa RNA-prov från LCM för noggrann kvantitativ genuttrycksanalys.
Men det finns några fallgropar som är förknippade med LCM tekniker. Till exempel, kan samla endast neuronala celler utan någon mikroglia kontamination vara nästan omöjligt. I pyramidala cellskiktet i hippocampus har det uppskattats att 95% av cellerna är nervceller med 90% av denna befolkning att vara pyramidala celler och 10% interneuronen, lämnar en liten andel av glia och andra celltyper. 8,17, 18 I våra studier använder vi fluor-jade en fluorescerande färg som specifikt märker bara skadade nervceller i hjärnvävnad. En annan fläck som är en markör för GFAP skulle vara nödvändigt att färga mikroglia. 19 Samla endast fluor-jade färgade enda neuronala kroppar ger en mer homogen population av neuroner. Ett annat vanligt problem som kan kräva felsökning är att en cirkel intet definieras när lasern avfyras. Om detta inträffar, är det nödvändigt att kontrollera laser inställningar och justera effekten och varaktigheten som behövs. Det är också viktigt att säkerställa att locket placeras plant på vävnaden och sitter ordentligt i armen. Med hänvisning till LCM tekniska manualen eller ringa teknisk support kommer ibland att vara nödvändig. Efter LCM och RNA isolering, bör kvaliteten på RNA alltid bedömas med hjälp av en bioanalyzer innan någon genuttryck analys.
Det finns flera typer av instrument laser capture närvarande finns på marknaden, inklusive laserskärning (Life Technologies, Leica Microsystems) och laser catapulting (Zeiss) instrument. Vårt LCM system fungerar bra för att fånga små mängder celler. Andra hög genomströmning och mer automatiserade system kan vara mer lämplig för att erhålla ett större antal celler för genomisk och särskilt proteomic analys. Faktum är LCM använda dessa automatiska system stor potential för analys av protein uttryck i identifierade celler eller berikade populationer av celler. 20 Vidare kan LCM underlätta analys genuttryck av immunolabeled celler, 21 gör att vi kan undersöka genuttryck i definierade celltyper oavsett komplexiteten i de mest heterogena vävnader. Således är LCM ett utmärkt verktyg för banbrytande molekylära studier av enstaka eller anrikade populationer av celler.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av R01 NS052532 (till HLH), Moody Foundation och Anestesi. Vi tackar Laurie Bolding, Christine Courteau Butler och Christy Perry för deras redaktionella hjälp och Christy Perry för layout och utmärkt produktion av alla figurer, tabeller och teckningar.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |