Rapid tests colorimétriques de vue qualitatif Distinguer l'ARN et de l'ADN dans les échantillons biomoléculaires

Une grande partie de la biologie cellulaire se produit via des interactions moléculaires impliquant l'ADN et de l'ARN. ⁴ Ces acides nucléiques d'origine naturelle (AN) interagissent les uns avec les autres, ^{5 pour} les protéines, les ⁶ et avec une multitude de composés à petites molécules et des ligands in vivo (par exemple, les cations divalents ^7). Les interactions peuvent être de courte ou de longue durée (cinétique), peut aller de modéré à élevé pour une faible affinité (force thermodynamique), et peuvent également présenter des variations importantes dans les propriétés chimiques et la spécificité – certaines associations sont très spécifiques (par exemple, l'ADN · · · facteurs de transcription, l'ARN · · · facteurs d'épissage), tandis que d'autres interactions sont nécessairement beaucoup plus générique (par exemple, l'ADN · · · bactériennes comme les protéines histone-HU ^8). Interactions non spécifiques avec AN peut avoir des conséquences pratiques pour les expériences in vitro impliquant des mélanges de biomolecules, comme il est possible, et même probable, que certains AN va associer avec les biomolécules d'intérêt, du moins dans un sous-ensemble des conditions expérimentales utilisées (force ionique, le pH, etc.)

Considérons, par exemple, la production d'une protéine d'intérêt (POI) par l'intermédiaire hétérologue sur-expression de la protéine recombinante dans la culture d'Escherichia coli cellule, une telle procédure est réalisée en routine dans pratiquement n'importe quel laboratoire de biologie structurale ⁹ En préparation pour d'autres expériences, comme. que la caractérisation biochimique / biophysique, cristallisation, etc., les premiers efforts se concentrent généralement sur ​​l'obtention d'une quantité suffisante de POI en tant que pure que possible, idéalement dans un échantillon chimiquement homogène et biophysique monodisperse. Après la perturbation des cellules hôtes, les premières étapes d'un flux de travail typique de purification visent à isoler le POI de E. coli protéines, des acides nucléiques, des débris de parois cellulaires,et d'autres composants du lysat cellulaire. Cependant, l'hôte AN peut co-purifient avec le POI pour plusieurs raisons physico-chimiques – un POI fortement basique peut non spécifiquement déroulant hôte d'ADN / ARN, le POI peut avoir un générique NA activité de liaison (par exemple, le susmentionné HU); le POI peut être une assez spécifique NA-binding protein, mais présentent une réactivité croisée avec des ARN ou ADN hôte; hôte AN peut interagir avec une matrice de chromatographie et de ce fait tout simplement co-éluer avec le POI, et ainsi de suite. Sans discrimination, de haute affinité de liaison de l'hôte AN vers un POI peut poser un problème épineux car les impuretés NA sera vraisemblablement d'entraver des expériences en aval (par exemple, les dosages d'anisotropie de fluorescence de POI contraignant • ARN ^10). Alternativement, POI imprévue · · · associations NA peut également être vu par hasard, que ces interactions éclairer nucléique du POI acide capacité de liaison. De toute façon, si AN sont des éléments clés ou de contaminants, il faut d'abord quantifier etidentifier le type (ADN, ARN) de co-purification AN en préparation pour les expériences en aval.

Plusieurs méthodes analytiques existent pour détecter et quantifier dans un échantillon AN. La plupart des méthodes disponibles sont fondamentalement soit spectrophotométrique (par exemple, A ₂₆₀ et des valeurs d'absorbance A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapports), fluorimétrique (par exemple, la liaison de thiazole orange ou d'autres colorants fluorescents à NA), ou colorimétriques (sensibilité de nucléosides à des réactions chimiques que chromophores absorbant rendement dans la région UV-VIS du spectre électromagnétique), comme l'a récemment décrit par De Mey et al. ¹ Toutefois, l'étape cruciale de l'identification du type de polynucléotide tel que l'ARN ou de l'ADN est au-delà de la portée d'un grand nombre de ces quantification approches. Ici, nous fournissons un ensemble de tests colorimétriques pour identifier rapidement les types de composants NA dans un échantillon protéique.

Les protocoles décrits ici cun être efficacement exécutée sans mesures supplémentaires d'isoler les impuretés potentielles NA, et reposent sur ​​le dosage de Benoît XVI pour les sucres réducteurs ^11, pour le dosage orcinol pentoses ^{12,13, 14,15} et réactions diphénylamine de 2'-deoxypentoses (figures 1 et 2) . Test de la Bénédict (figure 2a) utilise la capacité de la forme linéaire, à chaîne ouverte (aldéhyde) d'un sucre aldose à réduire Cu ^{2 +,} avec oxydation simultanée de carbonyle du sucre à un groupement carboxylate et production de Cu ₂ O en tant que insoluble précipité rouge. Cette réaction avec un résultat positif libres des sucres réducteurs, tels que les aldoses et les cétoses (qui convertissent les aldoses correspondants via les intermédiaires endiol), mais pas avec les sucres pentoses qui sont verrouillés en forme cyclique comme partie du squelette covalent de l'ADN ou un polynucléotide d'ARN. En raison de l'exigence minimaliste d'une fonctionnalité gratuite hémiacétal, autre compounds qui pourrait le test est positif dans cet essai – et donc agir comme interférents potentiels – notamment α-hydroxy-cétones et d'oligosaccharides de courte durée (par exemple, le maltose disaccharide). À la fois l'd'Bial orcinol (figure 2b) et Dische de diphénylamine (figure 2c) réactions sont basés sur la destruction initiale du squelette polynucléotidique, par l'intermédiaire d'une dépurination de l'nucléoside et d'acide ou encore catalysée par une base d'hydrolyse des nucléotides parent, pour donner furan-2 -carbaldéhyde (furfural) dérivés; ces dérivés réagissent ensuite avec soit un phénol polyhydroxylé tels que orcinol (Bial) ou diphénylamine (Dische l') les réactifs pour former des produits de condensation de couleur de la structure chimique largement inconnus. L'ADN par rapport à la spécificité de l'ARN du dosage Dische provient du fait que le sucre pentose doit être 2'-désoxygéné afin d'être sensible à l'oxydation à ω-aldéhyde hydroxylevulinyl, qui réagit en outre avec la diphénylaminedans des conditions acides pour obtenir un bleu vif condensat (figure 2c). En utilisant les protocoles simplifiés décrits ici, nous avons constaté que ces réactions colorimétriques spécifiques à sucre peut différencier entre l'ARN et de l'ADN, et indiquent également la présence de sucres réducteurs libres tels que le glucose, le fructose, ribose ou dans un échantillon biomoléculaire.