Онлайн-клеточной видео микроскопия грибкового патогена Фагоцитоз
Summary
Мы опишем методы для живых клеток видеомикроскопии<em> Candida Albicans</em> Фагоцитоза макрофагами. Эти методы позволяют стадии конкретного анализа миграции макрофагов, признание, поглощения и фагосомы созревания и выявить новые аспекты фагоцитоза.
Abstract
Фагоцитарная оформления патогенных грибов и микроорганизмов в целом, можно считать, состоят из четырех этапов: (I) миграцию фагоцитов к месту, где возбудители находятся; (II) признание патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) по шаблону Признание рецепторов (ОРР), (III), поглощение микроорганизмов связаны с фагоцитарной клеточной мембраны, и (IV), обработка охватившего созревания клеток в фагосомами и переваривания проглотить частицу. Исследования, оценки фагоцитоза в полном объеме являются информативными 1, 2, 3, 4, 5, но ограничены в том, что они обычно не нарушать процесс на миграцию, поглощения и фагосомы созревания, который может быть затронут дифференцированно. Кроме того, такие исследования оценки поглощения как единичное событие, а не как непрерывный динамический процесс. Недавно мы разработали передовые живых клеточных технологий обработки изображений, и объединили их с генетическими функционального анализа каквозбудителя и клетки-хозяева для создания междисциплинарной платформы для анализа врожденные иммунные функции клеток и грибковых патогенез. Эти исследования выявили новые аспекты фагоцитоза, что может наблюдаться только с помощью систематических временной анализ молекулярных и клеточных взаимодействий между человеческими фагоцитов и грибковых возбудителей инфекционных микроорганизмов и в целом. Например, мы начали определить следующие: (а) компоненты клеточной поверхности, необходимые для каждого этапа процесса признания, поглощения и уничтожения грибковых клеток 1, 6, 7, 8, (б) как геометрия поверхности влияет на эффективность поглощения макрофагами и убийстве дрожжи и клетки гиф 7, и (в) как поглощение приводит к изменению клеточного цикла и поведения макрофаги 9, 10.
В отличие от снимков одной точке времени, живых клеток видео микроскопия позволяет широкий спектр клеток-хозяев и патогенные для изучения в качестве соntinuous последовательности в течение продолжительного периода времени, обеспечивая пространственную и временную информацию о широком диапазоне динамических процессов, в том числе клеточной миграции, репликации и везикулярного торговлей людьми. Здесь мы подробно расскажем, как подготовить хозяина и грибковых клеток, а также провести эксперименты видео микроскопии. Эти методы могут предоставить пользователю руководство для будущих исследований с другими фагоцитов и микроорганизмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь метод для использования живых клеток видео микроскопии для изучения макрофагов фагоцитоз описано. Видео микроскопии предлагает несколько дополнительных слоев информации для анализа. Одним из основных преимуществ является то, что поглощение данные могут быть получены (от одного эксперимента) для любого момента времени протяжении 6 ч периода наблюдения. Более того, описанный способ позволяет дифференциального анализа отдельных стадий фагоцитоза. Мы, например, показали, что изменения в общем поглощение C. Albicans гликозилирования и морфогенеза мутантов макрофагов клеточных линий и первичных макрофагах может быть либо следствием изменений в миграции макрофагов к клеткам-мишеням или скорость поглощение раз межклеточных контактов установлено 7.
Есть ряд ошибок, чтобы избежать при проведении этих экспериментов. Во-первых, это очень важно обеспечить стабильные условия окружающей среды по всему экспериментальных процедурДюре. Это лучше всего достигается в экологических камеры, которая установлена в экспериментальных условиях за несколько часов до начала эксперимента. Качество видео очень сильно зависит от сложных модулей, которые используются инфракрасные лазеры для автоматического поддержания образца Z-позиция, независимо от механических или термических изменений устраняя таким образом необходимость корректировки ручной фокусировки.
Учитывая расширенные характер экспериментов, важно ограничить лазерного воздействия света и связанных фотообесцвечивания и фотопреобразования эффектов, которые могут быть сведены к минимуму за счет использования высоко флуоресцентные маркеры, которые способствуют низкой экспозиции. FITC протокол окрашивания описанный здесь, быстро и надежно. Как FITC является очень ярким и стабильным пятно, малое время экспозиции требуется, и это делает FITC идеально подходит для длительного покадровой фильмов. Тем не менее, мы обычно используют различные пятна цели, в том числе Calcofluor Белый и PKH красителей, а также отмеченных организмов.
<p cдевушка = "jove_content"> Большинство наших опубликована работа проводится с использованием широкого поля микроскопа, но экспозиция может быть сведено к минимуму дальнейшие помощью вращающийся диск конфокальной микроскопии и в наших руках, это очень важно для покадровой микроскопии 3D видео.Во время этого исследования, изображения были взяты в плен в 1 мин интервалами в течение 6 часов фагоцитоза анализа. Интервал между снимками может быть скорректирована в зависимости от исследуемого процесса. Например, интервал может быть уменьшен при исследовании быстротекущих процессов, таких как везикулярного торговлей людьми. Минимальный интервал времени будет ограничен микроскопа и камеры спецификаций. Есть некоторые соображения иметь в виду при настройке таймингов. Во-первых, уменьшение интервала между снимками будет означать меньшее количество точек может быть отображена и размер файла будет значительно увеличена. Напротив, увеличение изображения интервал слишком много сделает фильм потерять преемственности.
Этот подход может быть примененВ принципе для изучения других патогенов и поглощения умирают клетки хозяина. Например, недавно мы показали, что костного мозга, полученных от макрофагов sialoadhesin-дефицитных мышей проявляют значительно сократить обязательные и фагоцитоз сиалилированных Campylobacter jejuni 8. Тем не менее, размер цели является важным фактором для возможности, как анализ изображений становится все труднее с сокращением целевого размера ячейки. Сложное программное обеспечение анализа изображения имеет важное значение для экспресс-анализа микроскопии видео, и это должно сочетаться с соответствующей поддержкой биоинформатики для облегчения поколение алгоритмов для изучения миграции отдельных клеток и целых популяций клеток 7. Онлайн-клеточной видео микроскопии в сочетании со сложным программным обеспечением для анализа изображений в минуту за минутой анализ миграции и отдельных макрофагов C.albicans взаимодействия, предоставляет уникальную возможность заглянуть в сложности C. Albicans фагоцитоза macrophagES. Существует огромный потенциал для расширения этих методов для изучения других патогенов и фагоцитов (дендритных клеток, нейтрофилов), а также для разработки 3D-микроскопии видео изображения межклеточных взаимодействий более подробно или более физиологических поверхностей, таких как эпителиальных и эндотелиальных клеточных слоев. Этот метод является частью следующее поколение инструментов в исследовании хозяин-патоген взаимодействия и поможет генерировать подробные пространственные и временные информацию о широком диапазоне динамических процессов.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE является шотландский старший клинический научный сотрудник и признает поддержке Главного управления Scientist (SCD/03). Эта работа финансировалась Wellcome Trust гранта в LPE (089930). Narg финансировалось Wellcome Trust Программа грантов (080088) и оборудование Грант (075470) (для DeltaVision), и FP7-2007-2013 Грант (ЗДОРОВЬЕ-F2-2010-260338-Allfun). Мы хотели бы поблагодарить Университета Абердина средства визуализации, в частности, Кевин Маккензи, для поддержки и полезными советами.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
Referenzen
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -. P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
