के stereotactic इंजेक्शन MicroRNA-व्यक्त माउस हिप्पोकैंपस सीए 1 क्षेत्र को Lentiviruses और व्यवहार परिणाम का आकलन
Summary
MicroRNAs मस्तिष्क संरचना और समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका है. यहाँ हम अधिक अभिव्यक्ति एक इंजीनियर miRNA व्यक्त lentivirus के stereotactic इंजेक्शन का उपयोग कर हिप्पोकैम्पस miRNA के लागू करने के लिए एक विधि का वर्णन है. इस दृष्टिकोण का आकलन करने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से रास्ते के रूप में काम कर सकते हैं<em> Vivo में</em> विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में व्यक्त miRNAs का प्रभाव.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with naïve mice, mice injected with saline and mice injected with “empty” lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth’s magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.
Introduction
तंत्रिका तंत्र के कामकाज में विशेष miRNAs की भूमिका हाल ही में कई अध्ययनों में lentiviral इंजेक्शन द्वारा चुनौती दी गई है. MiRNAs अन्तर्ग्रथन संरचना 1, synaptogenesis 2 और synapse remodeling और रखरखाव 3 को बनाए रखने और फिर से आकार देने के लिए महत्वपूर्ण होना पाया गया है. ये अध्ययन दृढ़ता को आकार देने के लिए दोनों में और तंत्रिका तंत्र, संज्ञानात्मक समारोह के मुख्य उत्पादन को बनाए रखने में multileveled विनियामक प्रभाव के माध्यम से, miRNAs लगे हुए हैं कि सुझाव. कृंतक मस्तिष्क में विशिष्ट क्षेत्रों में lentivirus कणों की stereotactic इंजेक्शन अन्तर्ग्रथन आकारिकी और neuronal गतिविधि में परिवर्तन के लिए खोज में सक्षम बनाता है, और 4,5 से अधिक व्यक्त टेप के कार्यात्मक महत्व स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. MiRNA व्यक्त lentiviruses के साथ अच्छी तरह से परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की प्रत्यक्ष संक्रमण उम्र बढ़ने, मस्तिष्क संबंधी विकार और neurodegeneration की पढ़ाई में शामिल किया जा सकता है, miRNA का अध्ययनएस व्यवहार विनियमन 6-8 के दायरे में अब तक कम उन्नत राज्य में कर रहे हैं, और के stereotactic इंजेक्शन miRNA व्यक्त व्यवहार परीक्षण द्वारा पीछा lentivirus कणों ऐसे प्रयोजनों के लिए उपयोगी हो सकता है. से अधिक या कम अभिव्यक्ति उत्प्रेरण के लिए एक काफी अधिक श्रमसाध्य विधि आनुवंशिक तोड़े में या पीटा चूहों इंजीनियर शामिल है. जेनेटिक सिस्टम आगे अभिव्यक्ति पर सशर्त और अस्थायी नियंत्रण (जैसे Cre पर Lox, Tet सिस्टम) के लिए अनुमति दे सकते हैं, लेकिन ये शायद ही इंजेक्शन प्रक्रिया के स्थानिक विशिष्टता प्रदान करते हैं और leakiness की एक निश्चित राशि लगभग हमेशा वहाँ है. इसके अलावा, इंजीनियरिंग प्रक्रियाओं सर्जरी की आवश्यकता नहीं है और अपेक्षाकृत अच्छी reproducibility के साथ प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, वे धीमी गति से कर रहे हैं और बहुत अधिक मानव शक्ति और वित्तीय संसाधनों की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, के अस्थायी नियंत्रण खत्म हो गया है या इंजेक्शन चूहों में अंडर अभिव्यक्ति अनुवांशिक इंजीनियर चूहों की तुलना में कहीं अधिक सटीक है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक lentivirus की stereotactic इंजेक्शन के लिए दोनों के ऊपर से या विभिन्न जीनों और miRNAs के नीचे विनियमन विवो मूल्यांकन में लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से विधि है. मुख्य विकल्प तो एक बहुत अधिक कठिन और समय लेने वाली तकनीक…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन मस्तिष्क विज्ञान के लिए एडमंड और लिली Safra केंद्र (एस.बी. फेलोशिप), इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (एच एस के लिए अनुदान संख्या 378/11,) की विरासत विरासत बायोमेडिकल साइंस भागीदारी कार्यक्रम और वैज्ञानिक के लिए जर्मन इजरायल फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया है अनुसंधान और विकास (GIF) (एच एस के लिए अनुदान सं 1093-32.2/2010,).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
Referenzen
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