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Neurowissenschaften

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em> 자궁 내</em> 일렉트로 및<em> 생체 내</em> 생물 발광 상영

Published: September 24, 2013
doi:
10.3791/50146
, , , ,
1Department of Neuropathology,Medical School Düsseldorf, 2Department of Molecular Genetics,Weizmann Institute for Science, 3Center of Behavioral Neuroscience,University of Düsseldorf

Summary

유전자는 성인 동물의 행동이나 신경 병리학의 최신 연구에 신경 연결의 빠르고 목표 수정을 가능하게하기 위해, E16의 자궁 일렉트로 (IUE)의를 통해 피질 또는 쥐의 해마의 개발 과정에서 조작 할 수 있습니다. IUE 성공의 제어를위한 생체 영상의 출생은 공동 형질 루시 페라 제를 활성화 생물 발광에 의해 수행된다.

Abstract

자궁 일렉트로에서 (IUE)는 신경 세포의 발달을 조사하기 위해 뇌 세포의 유전자 조작을 가능하게하는 기술이다. 지금까지 성인 뇌의 행동이나 신경 병리학을 조사하는 IUE의 사용은 출생 후 동물의 비 침습 기술에 의해 IUE 형질 전환 성공의 모니터링을위한 불충분 한 방법으로 제한되었습니다.

본 연구의 경우, E16의 쥐 IUE 사용 하였다. 배아로 핵산의 뇌 실내 주입 후, 족집게 전극의 위치는 현상 피질 또는 해마 하나를 타겟팅 중요했다.

심실 공동 사출 및 3D 정량화 소프트웨어 IVIS 스펙트럼 장치를 사용하여 출생 후 생체 내 생물 발광에 의한 마취 라이브 P7 강아지의 루시페린 복강 주사 후 형질 감염된 세포의 루시퍼 라제 유전자 허용 모니터링의 일렉트로.

<p생물 발광에 의한 클래스 = "jove_content"> 지역의 정의는 명확하게 대뇌 피질과 해마 electroporations 구별 출생 후에 5 주 정도 시간이 지남에 길이 방향으로 신호를 감지 할 수 있습니다. 이 영상 기술은 우리가 세 3 개월 째 행동 조사를 수행하기 위해, 이후, 생물학적 효과를 유발하고 필요한 가정 형질 세포의 충분한 수의 새끼를 선택하는 것을 허용했다. 예를 들어,이 연구는 쥐의 대뇌 피질에 인간의 전체 길이 DISC1 유전자와 IUE는 암페타민 과민 반응을 이끌었다 고 보여줍니다. 공동 형질 GFP 생후 ≥ 6개월에 존재하는 유전자 발현을 나타내는 저온부에 사후의 형광 현미경으로 뉴런에서 발견 할 수있다.

우리는 출생 후 생물 발광 영상은 쥐의 IUE와 일시적인 형질의 성공을 평가할 수 있다는 결론을 내린다. neurodevelopmen 동안 국소 유전자 조작의 영향에 대한 조사성인의 뇌와의 연결에 t 크게 촉진된다. 많은 과학적인 질문을 위해,이 기술은 보완 또는 형질 전환 쥐의 사용을 대체 및 행동 신경 과학에 대한 새로운 기술을 제공 할 수 있습니다.

Introduction

그것은 상대적으로 쉽게 신경 발달 연구를 활성화하기 때문에 두뇌 개발에 유전자 발현의 조절을 할 수있는 자궁 일렉트로 (IUE) 방법의 개발, 돌파구이다.의 표적 유전자의 발현 수준에 1-7 변경 설치류에 배아 및 / 또는 주 산기 개발하는 동안 특정 뇌 영역이 영향을 신경 증식, 이동, arborization 및 연결 결정적 입증했다. 8-10

정신 분열증은 신경 발달 이상 (11, 12) 그러므로 정신 분열증에 대한 확인 된 후보 유전자의 많은에 대한 예를 들어 같은 신경 발달에 대한 잠재적 인 변조 효과를 조사하는 관련 된 급성과 만성 증상이 복잡한 정신 질환 인 중단 -에 – 정신 분열증 -1 (DISC1) 유전자 13-15.

두뇌 개발은 regulat입니다사전, 요정과 출생 후 발달 기간에 역할을하는 유전 적 요인과 환경과의 상호 작용에 의해 에드. 다양한 행동 장애에 대한 하나의 주요 유전 적 위험 요인은 쥐 13, 17 마이그레이션 결함 DISC1 16 유전자. DISC1 넉다운 리드하고, IUE에 의해 개발 피질 DISC1 식의 조작은 성인 마우스 (18)의 행동에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

IUE에 의해 뇌의 유전자 발현을 조작하는 것은 몇 가지 장점에게 유전자 변형 동물 라인의 세대에 비해 19 있습니다. 첫째, 관심 영역 내에서 유전자 발현은 달이 아닌 유전자 변형 쥐 라인을 사육의 여러 세대에 주 이내에 이루어집니다. 둘째, 생식 공학 동물 (20)의 표현형을 보호 할 수 있습니다 초기 개발시 보상 메커니즘을 피할 수 있습니다. 단지 특정 세포 집단 또는 뇌의 특정 영역, migrati을 대상으로를 통해, 세 번째또는 확산의 차이는 직접 비 돌연변이와 비교하거나 일방적 electroporations이 선택하는 경우 반대쪽을 제어 할 수 있습니다. 한편, IUE는 프로모터 구동 CRE / LOX 유도 식의 타이밍 및 특정 지역의 셀만을 모집단의 유전자 발현 패턴의 모자이크 종류 선도 대상의 정확성을 가지고 있지 않습니다.

안정, 생식선 – 형질 전환 설치류의 주요 장점은 무시할 수 있도록 성체 설치류에서 많은 실험 애플리케이션의 뇌 영역에있는 셀들의 한정된 수의 일시적인 형질 감염은, 충분한, 또는 바람직 할 수있다. 사실, IUE 일부 비정상적으로 개발 된 세포가 세포 나 회로의 전체 네트워크에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하는 데 유용합니다. 또 다른 장점으로 인해 히트의 모자이크 성격 유전자의 비 세포 자율적 인 효과를 입증 할 수있는 능력이 될 수 있습니다. 또한, 유전자 변형과 녹아웃 쥐의 발생을 초기 단계 및 사용에게 아직비정상적인 두뇌 발달의 결과를 연구하는이 종 IUE의 높은 관심이다.

지금까지, 인원수 등 그 동물에 개입 결과를 조사 할 IUE 사용의 주요 장애물은 모니터링 일렉트로 성공의 부족이다. 지금까지, 라이브 신생아 래트 새끼 적합한 쌍안 형광 현미경 또는 IVIS 스펙트럼의 형광 이미징 검출 할 수없는 형광 뉴런 GFP – 코 – 형질.

이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 루시퍼 라제 리포터 유전자를 공동 형질과 IUE 뇌 영역의 3 차원 (3D) 정량에 의해 새끼의 생물 발광 라이브 영상을 수행 하였다.

신경 발달 유전자 조작, 쥐 태아의 뇌실에 인간의 DISC1, 루시퍼 라제 및 GFP를 포함하는 플라스미드의 공동 주사를 테스트하기 기능 분석에이 방법의 적용 가능성을 입증하기위한 예를 들어 <su트위터 전극과 일렉트로 다음 P> (3)을 수행 하였다. 형광 신호가 생체 내에서 출생 후의 단계에서 검출되지 않을 수 있지만, 공동 형질 루시퍼 라제 유전자에 의해 루시페린의 신진 대사에서 파생 된 고체 생물 발광 신호는 출생 후 5 주까지 검출되었다. 부족하거나 잘못된 일렉트로와 새끼가 IUE 동물의 할당을 가능하게하여, 처음부터 확인 (관심의 유전자를 제어 스크램블) 낮은 변동성의 일치 일렉트로 뇌 영역과 실험군으로 하였다있다 일렉트로 뇌 영역 허용 정량의 3D 측정 . 행동 패러다임 어른 IUE 쥐의 사용은이 프로토콜의 유용성의 예를 들어 설명 하였다.

Protocol

국가 및 유럽의 법률에 따라, 모든 동물 실험은 책임 Landesministerium FÜR 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz (87 51.05.2010.A​​301 LANUV NRW)에 의해 승인되었다. 1.에서 자궁 에레 이 방법은 Walantus 외. 3 기준 쥐뿐만 아니라, 밥 등. 4 조브에 상세히 설명되어 여기에서는 간략하게 요약되어있다. 6-8 새끼의 쓰레기 크기는 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. (아래 참조) 생존율을 증가시키기 위해 적어도 두 개의 비 – 일렉트로 배아가 있어야한다. 1.5 ㎍ / μl를 포함 DNA-혼합물을 제조 목표 플라스미드 (shRNA를 : pENTR-U6, 인비 트 로젠, 유진, OR / DISC1 과발현 : pCAX 21), 0.5 ㎍ / 플라스미드 (pCAX), 0.5 ㎍ / GFP μl를 포함하는 루시 페라 제 μL 1X PBS 솔루션 스테인드 빛 블루의 플라스미드 (는 pCAGGS 22)를 포함빠른 녹색 염료와 전자. 바늘 피펫 끌어 당기는 유리 모세 혈관 밖으로 주사 바늘을 준비합니다. 그리고 알코올 성분의 소독제 (kodan Tinktur 포르테)와 고압 증기 멸균 또는 배양하거나 수술 도구를 소독. 15 분 수술 전 십육일 수정 (E16) 후 임신 한 쥐에 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)의 수술 전 투여 량을 관리 할 수​​ 있습니다. 그 후 이소 플루 란 챔버에 동물을 마취. 마취시, 1.8 %에서 0.4 L / 분 이소 플루 란에 산소 설정을 사용하여 마취 장치에 연결 호흡 마스크와 37 ° C 예열 작업 테이블에 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 복부를 면도 후 면도 면적에게 kodan Tinktur 포르테 (알코올 성분의 소독제)으로 3 회 소독. 만 면도 작업 필드를 노출, 멸균 천과 쥐를 커버. 자궁 일렉트로에 수행합니다. scisso와 복부를 잘라리네아 알바 따라 R (~ 2cm). 링 집게로 조심스럽게 자궁 뿔을 노출합니다. 전체 수술 중 가온 멸균 PBS에 젖은 자궁 벽을 유지하기 위해주의하십시오. 배아의 뇌실 중 하나에 얇은 유리 바늘 DNA 용액을 주입한다. 태아의 머리 주위에 7mm 전극을 배치합니다. 상단에 대뇌 피질의 층의 세포 집단을 치고, E16 23에서 IUE을 수행하고 약간의 지느러미 / 측면 경향이 주입 된 심실 위의 반구에 긍정적 인 전극을 배치합니다. 해마 세포가 측면으로 주입 된 심실보다 반대편에 긍정적 인 전극 배치를 변경 대상에 약간 등의 방향 (그림 1). 사각 파 펄스 electroporator 950 밀리 초 나누기 55 V에서 다섯 50 밀리 초 펄스로 전기 충격을 수행합니다. t를 증가시키기 위해 각각의 자궁 뿔의 질 끝에 제 배아 예비그는 모든 배아의 생존의 기회. 다시 어머니의 쥐에 자궁 뿔을 넣어. 흡수 Vicryl 수술 봉합사와 복부 벽을 STICH. Vicryl 봉합사 재료 또는 봉합 클립으로 피부를 닫습니다. 다시 홈 케이지에 어머니의 쥐를 넣고 2 ~ 3 시간 동안 보온. 동물 시설의 방에 자신의 홈 케이지에 혼자 쥐를 잡고 임의로 먹이. 그들은 E22-24 사이에 출생을 제공합니다. 셋째 주 자신의 어머니와 함께 쥐의 새끼를 유지하고 성별 이후를 구분합니다. 2. 루시퍼 라제 효소 반응의 생물 발광 실시간 이미징 이 방법은 자궁 내에서 형질 감염된 세포의 위치를 분석하는 데 사용된다. 공동 일렉트로 반딧불 루시 페라 제 cDNA를 oxyluciferin하는 D-루시페린 대사에, 광자 (그림 2를 방출 활성 루시퍼로 번역 </stronG>). 그 결과 발광는 출생 후 (그림 4) 약 35 일 세까지 IVIS 스펙트럼에 긍정적 인 일렉트로 젊은 쥐의 뇌에서 발견 할 수있다. 본 연구에서, 루시 페라 제 분석 및 생물 발광 영상은 P7에서 시작 하였다. 이 시점은 어머니와 새끼는 출생 스트레스로부터 복구 할 수 있도록 선택되었다. 처음 P0에서 새끼와 함께 작업 할 때, 강아지의 생존에 심각한 새끼가 죽은 채 발견 또는 어머니에 의해 먹게 된 점에서 영향을 받았다. 처음에는 성공 일렉트로와 쥐의 새끼는 3 분 노출 시간을 2 차원 생물 발광의 사진으로 식별됩니다. 이어서, 긍정적 새끼는 일렉트로 영역의 위치를​​ 지정하기 위해 3D 이미지를 만들기 위해 사용된다. ML 15 ㎎ /의 농도로 PBS에 D-루시페린 나트륨 염을 희석하고 멸균 주사기 필터를 통해 여과하여 소독. 새끼의 무게를. 상단 복부에 한 손으로 강아지를 타고 약간 복부를 스트레칭. 루시페린 솔루션 복강의 체중의 10 μL / g을 주입한다. 나이가 더 민첩 사람을 위해, 루시페린을 주입하기 전에 유도 챔버에서 이소 플루 란과 새끼를 미리 마취시키다. 3 % 이소 플루 란과 IVIS 스펙트럼 내에서 XGI-8 가스 마취 시스템의 이소 플루 란 유입을 켭니다. 마취 시스템의 유리 코 콘에 동물의 주둥이를 넣습니다. 그것은 깊은 마취 (2 ~ 3 분)가 될 때까지 발생하기 쉬운 위치에있는 동물을 잡아. 그 후 1.5 %로 이소 플루 란 유입을 줄일 수 있습니다. 전체 쓰레기의 양 새끼를 선택하기 위해 2 차원 생물 발광 측정을 선택합니다. 다음 설정을 사용 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . CHEC을 설정kmark 8의 중간 비닝 (binning) 및 F / 정지와 사진에 카메라가 측정을 시작한 후 위의 사진을 걸립니다. 설정 여기 필터 : 블록. 매연 필터를 설정 : 개방. 매체에 비닝을 설정합니다. 1에서 F / 정지를 설정합니다. 설정 스테이지 레벨 A. 180 초에 발광 노출 시간을 설정합니다. 더 좋은, 긍정적 인 새끼에서 일렉트로 영역을 정량화 반딧불 루시 페라 제에 대해 다음 DLIT 설정을 사용하기 위해 3D 그림의 제작을위한. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 사진에 체크 표시를 설정하고, 카메라는 측정을 시작한 후 위의 사진을 걸립니다. 구조에 체크 표시를 설정, 동물의 표면은 이전에 생물 발광 측정 IVIS에 의해 검색됩니다. 유SE 2 주 세까지 배출 필터와 노출 시간 설정을 다음과 같은 : 매연 필터 (1) : 590 nm의, 노출 시간이 300 초 매연 필터 (2) : 600 nm의, 노출 시간이 240 초 매연 필터 (3) : 620 nm의, 노출 시간이 180 초 매연 필터 (4) : 640 nm의, 노출 시간이 120 초 P20보다 나이가 쥐 매연 필터 (1) : 600 nm의, 노출 시간이 300 초 매연 필터 (2) : 620 nm의, 노출 시간이 300 초 매연 필터 (3) : 640 nm의, 노출 시간이 300 초 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 인해 이전 동물에서 신호 강도의 감소로, 노출 시간은 세 가지 유용한 방출 필터에 대해 확대된다. 설정 단계 레벨 B 매체에 비닝을 설정합니다. 1에서 F / 정지를 설정합니다 후 측정, 3 월 서로 구별하기 귓구멍 코드 쥐 K와 IVIS 라이브 영상 이미지에 일치하도록 측정 절차의 마지막에, 이소 플루 란의 유입을 끄고 케이지에 반환하기 전에 몇 분 동안 예열 접시에 쥐를 유지합니다. 3. 생물 발광 이미지 분석 3D 영상, 3D 영화 및 신호 소스의 볼륨의 정량의 발생은 생활 이미지 소프트웨어 IVIS 스펙트럼에 사전 설치에 의해 이루어집니다. 3D 영상의 생성 첫째, 표면 지형을 재구성 따라서 20 ~ 30 % 사이의 임계 값을 설정합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . EEN 6 "SRC ="/ files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> 각 파장에 대한 10 %의 이미지 임계 값과 DLIT 3D 재건을 시작합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 3D 도구 모음에서 애니메이션 버튼을 사용하여 3D 영화를 만들 수 있습니다. 3D 이미지의 서로 다른 방향뿐만 아니라, 키 프레임으로 확대보기를 선택하고 '기록 & #을 누르39, 버튼, 하나의 위치 / 방향에서 다른 전환을 기록. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 4. 행동 테스트 행동 시험은 쥐의 IUE-매개 유전자 조작이 성인으로 지속 장기적인 효과를 시작할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 수행되었다. 본 특정 경우에, 과도의 효과는, IUE 후 일방적 전체 길이 인간의 DISC1의 대뇌 피질의 과발현은 도파민 관련에 대한 특정 시험으로, 암페타민의 낮은 복용량과하지 않고, (의)의 열기 필드에서 운동을 테스트하여 조사 하였다 문제 24. 에 의해 수행되는 유사한 절차에 니와 등. DISC1의 최저, IUE 마우스 아니지만을 사용 IUE 마우스의 컨트롤이 과민 반응을 보였다18 암페타민. 자궁에 DISC1 과발현 벡터로 일렉트로 된 쥐 오전 7시부터 오후 7시까지 12 시간 빛과 실험실 조건에서 개최하고, 임의로을 공급 하였다. 세 3 개월에서, 쥐의 행동 실험을 시행 하였다. 암페타민의 효과를 판독, 소리와 빛 격리 된 챔버에 위치한 트루 스캔 작업 시스템의 오픈 필드로 운동을 정량화하기 위해 사용되었다. 이 시스템은 지속 시간을 측정하고, 개방 공간의 여백 또는 중앙에서 소요 동물 이동 시간과 거리를 거리뿐만 아니라, 동작 (25)를 양육. 첫 날, 식염수 주사 후 시험 동물의 무게를 측정. 복강 내로 생리 식염수 (1X PBS) 1 μL / g의 체중을 주입한다. 마우스 오른쪽 버튼으로 주사 후, 오픈 필드에 동물을 넣고 TruScan의 시스템의 측정을 시작합니다. 15 분 녹음D 3 × 5 분의 부분으로 데이터를 분할. 다시 홈 케이지에 동물을 넣어. 암페타민 주사에 둘째 날 테스트 동물의 무게를 측정. 복강 0.5 ㎎ / ㎖ 암페타민 용액 1 μL / g 체중을 주입. 주사는 오픈 필드에 동물을 넣고 TruScan의 시스템의 측정을 시작 직후. 15 분 녹음하고 3 × 5 분의 부분으로 데이터를 분할. 자신의 홈 케이지에 동물을 반환합니다. 운동 및 특정 트루 스캔 소프트웨어에 의해 생성 된 양육 행동을 분석 할 수 있습니다. 그래프 패드 (프리즘)와 그래프를 작성하고 SPSS 통계 소프트웨어 통계를 계산합니다.

Representative Results

그림 3은 150 밀리그램의 루시페린 / kg 체중의 주사 후 P7에서 세 쥐 새끼의 영상 측정을 살고있다. IUE의 효율의 변동을 나타내는 신호 강도의 차이를 볼 수있다. 강한 생물 발광 신호는 P36 (그림 4)까지 기록되었다. 그림 5에서, 생물 발광 영상에서 대뇌 피질 (도 5A 및 5C)와 해마 (그림 (b)와 (d)) 일렉트로을 정의 할 수있는 기능이 그려져있다. 두개골 제거 (그림 7B)와 P14의 저온 절단 된 뇌 (그림 8)에서 해당 GFP – 일렉트로 세포 후의 형광 신호와 생물 발광 신호 (그림 7A)의 상관 관계는 그림 6-8에 묘사되어있다. 참고로, 더 있었다 어떤 시점에서 살아있는 쥐의 형광 신호의 검출. 십t "> 생체 내 생물 발광 영상은 표시된 예에서. 2D로 다른 일렉트로 뇌 영역의 대략적인 차별 크게 3D 이미지 (그림 5C 및 5D)를 생성 IVIS 스펙트럼 소프트웨어의 DLIT 프로그램 개선 (도 5A 및 5B)를 수 , 전두엽 피질과 해마의 일렉트로는 구별 할 수 있습니다. 그것은 해마를 electroporate을 목표로하면서, 해마의 피질 거짓말 등의 일부 전구 세포는 또한 (그림 7) 타격을받을 수 있다는 것을 유의해야한다. 일방적으로 자궁의 피질에 pCAX 벡터로 electroporation하여 이후에 전체 길이 인간의 DISC1을 발현하는 쥐가 성인과 자연과 암페타민에 의한 과잉 행동 모두에 대해 조사 하였다. pCAX-DISC1과 일렉트로 쥐 암페타민의 낮은 복용량에 과민했다. 이 쥐가 크게 개월 이동다시 후 식염수 주입보다 암페타민 처리, 후 반면 대조군 (그림 10)하지 않았다. 그림 1. A) 피질 일렉트로 및 B) 해마의 electroporation에 대한 전극 위치의 계획, 녹색 = 뇌실 내 DNA-믹스를 주입했다. 그림 2. 루시 페라 제 반응. 그림 3. / kg 체중 luciferine 150 mg을 주입 후 P7 래트의 발광 측정, 노광 시간 180 초, 노 발광 신호 A) 쥐; B) 쥐 약한 생물 발광 신호, 강한 발광 신호 C) 쥐. 그림 4. IUE 성공을 검출 할 수있는 많은 시간 창을 보여주는 150 ㎎ / kg의 luciferine의 주입 후 동일한 래트 연속 생물 발광 측정 시간 라인. 해마에서 B) & D). C) & D) 3D 사진;; 피질에서) & C). P7 A) & B의 대뇌 피질과 해마 일렉트로의 차이) 2D 그림의 그림 5와 그림.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6. P14의에서 쥐 강아지의 E16 ​​해마의 electroporation) 생물 발광의 B의 2 차원 그림) 생물 발광 신호 C의 3D 그림)의 그림은 생물 발광 신호 D) 뇌 GFP 에피 형광 신호로 뇌를 해부. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 7. GFP 포함하는 플라스미드 및 루시퍼와 일렉트로 같은 P14 쥐 뇌의 20 μm의를내는 부분에서 형광 영상의 세부 사항벡터, DAPI로 핵 염색, CA1-3 = 뿔 Ammonis 1-3, DG = 치아 이랑 (dentate gyrus), FC는 = Fasciolarum cinereum. 비디오 1. 해마의 3D 애니메이션은 P14에 쥐 일렉트로. 그림 8. 암페타민 테스트 방식 : 첫날 식염수 주입 15 분 시험 전에, 24 시간 이후 암페타민 열기 필드 챔버에서 테스트하기 전에 주입. 그림 9. 암페타민 테스트. . 회색 막대 = DISC1 과발현 군,, 대조군 N = 10, 15 분 화이트 바 = 대조군에 비해 TrueScan 시스템에 의해 기록 된 동물 (cm)는 이동 된 거리를 표시하는 막대 그래프 DISC1 과발현 그룹 N = 11; ANOVA : GENO * 치료 P = 0.043; 암페타민 NS 대 총 시간 식염수 = 중요하지 pcontrol = 0.172, pDISC1 = 0.001 T-테스트.

Discussion

우리의 연구는 IUE가 뉴런이 뇌의 선택 영역에서 유전자를 발현하고, 이것은 간섭의 결과로,이 동물은 수행 조작의 기능을 나타내는 행동의 변화를 나타낸다와 성숙한 쥐를 생성하는데 적합 것을 보여준다. 본 연구에서는, 예를 들어, 전두엽 피질의 작은 부분에 일방적으로 DISC1을 과발현 쥐 암페타민으로 과민 반응 (그림 9)를 보여 주었다.

생체 내 생물 발광 영상으로 일렉트로의 성공을 위해 쥐를 선택하면 IUE 세포 형질 전환에 내재 된 변동성을 통제하는 효과가 나중에 수사 낮은 간 주제 가변성의 균일 한 IUE 지역으로 그룹을 생성하기 위해 적용되었다.

이 연구에서, 우리는 심지어 그래도, 갓 태어난 동물의 공동 일렉트로 GFP에 의한 형광 검출하여 쓰레기에서 일렉트로 새끼를 선택 할 수 없습니다우 동일한 시간에 동일한 동물에 동등하게 공동 일렉트로 루시 페라 제의 생물 발광 신호는 루시페린 주입 (그림 6) 이후에 검출 할 수 있고, 신경을 표현 GFP 6 개월의 나이에 아직도 뇌에 존재했다. 우리는 쥐에, 루시 페라 제 / 루시페린 반응이 성공적으로 일렉트로 두뇌를 가진 동물 (그림 3)을 구분하기 위해 매우 적합하다는 것을 결론을 내린다.

IUE 성공 정량적 모니터링 동일한 노광 시간 (도 3) 내의 광자의 카운트에 의해 측정 공동 발현 루시퍼 라제의 효소 활성에 대응되는 생물 발광 신호의 강도에 관한 것이다. 작은 생물 발광 신호는 6 개월 쥐의 뇌의 조직학 ~ 1 × 4 광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안 쇼 1,000-2,000 GFP – 염색 된 세포의 생기에, 광자의 100 ~ 200 카운트에 의해 검출하고,. 가장 높은 신호 DISP의 윤기를 누워 ~ 5 × 6 광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안와 ~ 64,000 카운트까지.

사용되는 스프 라그 돌리 쥐 변형, 우리는 연령 증가에 길이 방향으로 생물 발광 신호의 약화를 관찰하고 신호는 P35의 나이 (그림 4)을 넘어 사라졌다. 이 시점에서, 우리는 루시퍼의 과도, 플라스미드 벡터 기반의 표현식이 감소, 또는 생물 발광 신호가 증가로 인해 뇌의 질량, 또는 둘 모두가 사라지는 신호에 대한 원인입니다을 약화 경우 여부를 알 수 없습니다. 성인 쥐의 본 기능 분석을 위해, 행동 연구에 대한 선택은 단순히 신호의 위치에 따라 제 아니지만 생물 발광 신호 강도 하였다.

3D 양적 생물 발광 모니터링은 다른 일렉트로 영역 (그림 5) 사이의 차별화 허용하더라도, 그 정확함은 깊이 다임에있는 셀에 대한 제한되었다뇌 nsion.도 6은 2D 및 3D 영상에 생물 발광 측정이 일렉트로의 좋은 위치를 지시 한 해마 일렉트로의 예를 나타낸다. 해부 사후 뇌에서 GFP 형광 신호가 해마의 정확한 타겟팅을 나타내는 생물 발광 신호와 같은 위치에 대한 검출되었다. 그러나 조직학 쇼는 해마의 피질 등의 세포 (그림 7)을 대상으로했다 그. 이 생물 발광 분석은 긍정적, IUE 새끼를 감지하고 또한 일렉트로 지역의 아이디어를 가지고 있지만, 궁극적으로, 영상은 정확히 적극적으로 타겟 세포를 집중에 사후의 조직학을 대체 할 수있는 유용한 도구임을 나타냅니다.

이 데모는 C에 aberrances을 시뮬레이션하는 대뇌 피질이나 해마 뇌 영역의 미묘한 대상 조작을 생성하는 IUE 기술의 응용 프로그램에 대한 약속을 나타냅니다ortical 마이그레이션 또는 성인 동물에 영향을 미칠 수있는 다른 신경 발달 결함. 양자 일렉트로 26 거동에 큰 영향 가능성의 이점을 가지고 있지만, 태아를 더 사망률도있다. 일방적 인 일렉트로는 일방적, 작은 지역에도 IUE 조작이 동작을 변경하려면 충분하다는 것을 표시하기위한 내부 통제와 같은 하나,뿐만 아니라 함께 두 개의 반구를 비교하기 위해 선택되었다. 뉴런 사이의 연결이나 건축 IUE 유도 변경하여 적절한 행동 테스트와 병변 – 수 – IUE-조작 영역의 필요한 경기를 되살리는없이 유도 할 수있다하는 것은 과학적인 문제에 따라 달라집니다.

트러블 슈팅

감소 산자 IUE 새끼의 생존을 증가에 대한 몇 가지 제안이 있습니다. 첫째, 전기 천공 중에 매우 얇은 유리 모세관의 사용 조직 lesio을 최소화하기 위해N을 권장합니다. 둘째, 각각의 자궁 뿔의 질 끝에 첫 번째 배아를 electroporate하지 않습니다 장자 배아의 죽음은 다른 모든 배아의 중단의 가능성을 증가시킨다. 셋째, 출산 후, 어머니의 쥐가 자주 인해 주 산기 스트레스에 그들의 자손의 일부를 죽일. 추가적인 응력을 감소시키기 위하여, 오른쪽 생후 라이브 촬상로 시작하지 않지만, 칠일 기다린다.

새끼의 GFP 형광 검출

1 주로 출산 후, I​​VIS 스펙트럼과 라이브 양안 형광 현미경 영상 또는 형광 이미징을 사용하여 하나에 의한 형광 신호 없음 (표면 형광 및 transfluorescence 모드, GFP 여​​기 / 방출에 대한 : 520분의 465 nm의 540분의 500 NM). 또한, 피부의 두개골과 높은 자기 형광 배경처럼 조직 내지 단파장 여기 및 발광 광의 제한된 전송 DESC 하에서 형광을 사용하여 둘 것을 방지 할 수있다쥐의 조건을 ribed. 도 6에 도시 된 바와 같이, 살아있는 동물에서 루시퍼 신호는 또한 (두개골)없이 해부 뇌에서 검출 될 수있어, 또한 형광 신호는 (도 6D) 검출이다.

근접한 뇌 영역에있는 생물 발광의 분화

심지어 3D 그림에서 생물 발광 영역의 위치가 100 %로 예측 될 수 없다. 또는 예측 된 영역의 아래 위에 특히 세포는 또한 실수로 대상 및 형질 전환 할 수 있습니다. 정확한 위치는 (그림 7 참조) 사후의 (형광) 조직 학적으로 제어 할 수 있습니다.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 플라스미드를 제공하는 트레이시 영 피어스 아츠시 다니 감사합니다.

CK, 그리고 질량 (DE 792/2-4)이 작품은 OR과 CK (BMBF 01EW1003), DFG (GRK1033 코 1679/3-1)에 신경 세포 ERANET 발견에 의해 투자되었다

Materials

Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke & Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors – sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O		 100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

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Referenzen

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Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).
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