Summary

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Published: January 24, 2013
doi:

Summary

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een robuuste<em> In vivo</em> Lees-out van inbeslagneming-achtige activiteit. Deze techniek kan worden gebruikt met genetisch gemodificeerde zebravissen larven die epilepsie genen of aanvallen opgeroepen door toediening van convulsief drugs.

Abstract

Epilepsie treft bijna 3 miljoen mensen in de Verenigde Staten en tot 50 miljoen mensen wereldwijd. Gedefinieerd als het optreden van spontane niet-uitgelokte aanvallen, kan epilepsie worden verworven als gevolg van een beschadiging aan de hersenen of een genetische mutatie. Inspanningen om het model aanvallen bij dieren is in de eerste plaats gebruikt verworven beledigingen (convulsieve geneesmiddelen, stimulatie of hersenletsel) en genetische manipulaties (antisense knockdown, homologe recombinatie of transgenese) bij knaagdieren. De zebravis is een gewervelde modelsysteem 1 tot 3, dat een waardevol alternatief voor knaagdieren op basis van epilepsie onderzoek zou kunnen bieden. Zebravissen worden veel gebruikt in de studie van vertebrate genetica of ontwikkeling, een hoge mate van genetische gelijkenis met zoogdieren en drukken homologen voor ~ 85% van bekende menselijke enkel gen mutaties epilepsie. Vanwege hun geringe omvang (4-6 mm in lengte), zebravis larven worden gehandhaafd fluïdumvolumes zo laag als 100 ul tijdens de vroege ontwikkeling en arraYed in multi-well platen. Reagentia kunnen direct worden toegevoegd aan de oplossing waarin embryo's ontwikkelen, vereenvoudigen toediening en die een snelle in vivo screening van testverbindingen 4. Synthetische oligonucleotiden (morfolino), mutagenese, zinkvinger nuclease en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om snel genereren gen knockdown of mutatie in zebravis 5-7. Deze eigenschappen bieden zebravis studies een ongekende statistische power analyse voordeel ten opzichte van knaagdieren in de studie van neurologische aandoeningen zoals epilepsie. Omdat de "gouden standaard" voor epilepsie onderzoek is het monitoren en analyseren van de abnormale elektrische ontladingen die ontstaan ​​in een centrale structuur van de hersenen (dat wil zeggen, toevallen), een methode om efficiënt op te nemen hersenactiviteit in larvale zebravis wordt hier beschreven. Deze methode is een bewerking van conventionele extracellulaire meettechnieken en zorgt voor een stabiele lange-termijn monitoring van de hersenactiviteit in intacte zebravis larven. Sruime opnames worden getoond voor acute aanvallen geïnduceerd door bad toepassing van convulsieve geneesmiddelen en spontane aanvallen vastgelegd in een genetisch gemodificeerde vis.

Protocol

1. Ei en afhaling Zebravis veeteelt volgt standaardprocedures eerder beschreven 8. In het kort worden volwassen zebravis opgericht in kweekbakken met verdeelschotten op zijn plaats. Wanneer de verlichting in de kamer komen op de volgende ochtend, worden verdelers uit kweekbakken en vis zijn ongeveer 20 tot 60 minuten van de ongestoorde paartijd toegestaan. Eieren van de fokkerij tanks worden verzameld in een zeef en gespoeld met ei water. Eieren worden vervolgens overgebracht naar een pet…

Representative Results

Voorbeelden van elektrografische beslag-achtige ontlading opgenomen in de voorhersenen van een agar ingebedde zebravis larven worden getoond in Figuur 1. Grote amplitude multi-spike burst ontlading in deze monsters werd opgewekt door toepassing van een bad convulsant geneesmiddel, 40 mM pilocarpine (in A, 6 dpf) of 1 mM picrotoxin (in B, 8 dpf). In deze opnames geïmmobiliseerd en agar ingebedde zebravissen worden continu bewaakt tot 90 min. Vissen levensvatbaar blijven onder deze opnameomstandigheden t…

Discussion

De extracellulaire methode hier gepresenteerde maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van de hersenactiviteit. Deze opnames zijn analoog aan elektro-encefalogram (EEG) monitoring vaak gebruikt om de aanwezigheid van abnormale elektrische ontlading (dat wil zeggen, in beslag) in diermodellen voor epilepsie 11 en patiënten van 12 te evalueren. Extracellulaire opnamen kunnen worden gecombineerd met farmacologische manipulaties, zoals hier getoond. Deze soorten opnamen kunnen ook worden g…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteur wil Peter Castro en Matthew Dinday bedanken voor hun vroege pogingen om zebravis te vestigen in het laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health EUREKA subsidie ​​(# R01NS079214-01).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Agarose low melting Fisher-Scientific BP1360-100 Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media Fisher-Scientific BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2
pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine Argent Labs MS-222 0.02%
α-bungarotoxin Tocris Bioscience 2133 1 mg/ml
Capillary glass tubing Warner Instruments G120TF-3 Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier Warner Instruments PC-505B We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions.
Filter/amplifier Cygnus Technology FLA-01 We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions.
Axon A/D board and Axoscope software Molecular Devices Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions.
Egg water Instant Ocean   3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water

Referenzen

  1. Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
  2. Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
  3. Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
  4. Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
  5. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
  6. Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
  7. Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  9. Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neurowissenschaften. 131 (3), 759 (2005).
  10. Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
  11. Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
  12. Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
  13. Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
check_url/de/50104?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (71), e50104, doi:10.3791/50104 (2013).

View Video