Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een robuuste<em> In vivo</em> Lees-out van inbeslagneming-achtige activiteit. Deze techniek kan worden gebruikt met genetisch gemodificeerde zebravissen larven die epilepsie genen of aanvallen opgeroepen door toediening van convulsief drugs.
Epilepsie treft bijna 3 miljoen mensen in de Verenigde Staten en tot 50 miljoen mensen wereldwijd. Gedefinieerd als het optreden van spontane niet-uitgelokte aanvallen, kan epilepsie worden verworven als gevolg van een beschadiging aan de hersenen of een genetische mutatie. Inspanningen om het model aanvallen bij dieren is in de eerste plaats gebruikt verworven beledigingen (convulsieve geneesmiddelen, stimulatie of hersenletsel) en genetische manipulaties (antisense knockdown, homologe recombinatie of transgenese) bij knaagdieren. De zebravis is een gewervelde modelsysteem 1 tot 3, dat een waardevol alternatief voor knaagdieren op basis van epilepsie onderzoek zou kunnen bieden. Zebravissen worden veel gebruikt in de studie van vertebrate genetica of ontwikkeling, een hoge mate van genetische gelijkenis met zoogdieren en drukken homologen voor ~ 85% van bekende menselijke enkel gen mutaties epilepsie. Vanwege hun geringe omvang (4-6 mm in lengte), zebravis larven worden gehandhaafd fluïdumvolumes zo laag als 100 ul tijdens de vroege ontwikkeling en arraYed in multi-well platen. Reagentia kunnen direct worden toegevoegd aan de oplossing waarin embryo's ontwikkelen, vereenvoudigen toediening en die een snelle in vivo screening van testverbindingen 4. Synthetische oligonucleotiden (morfolino), mutagenese, zinkvinger nuclease en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om snel genereren gen knockdown of mutatie in zebravis 5-7. Deze eigenschappen bieden zebravis studies een ongekende statistische power analyse voordeel ten opzichte van knaagdieren in de studie van neurologische aandoeningen zoals epilepsie. Omdat de "gouden standaard" voor epilepsie onderzoek is het monitoren en analyseren van de abnormale elektrische ontladingen die ontstaan in een centrale structuur van de hersenen (dat wil zeggen, toevallen), een methode om efficiënt op te nemen hersenactiviteit in larvale zebravis wordt hier beschreven. Deze methode is een bewerking van conventionele extracellulaire meettechnieken en zorgt voor een stabiele lange-termijn monitoring van de hersenactiviteit in intacte zebravis larven. Sruime opnames worden getoond voor acute aanvallen geïnduceerd door bad toepassing van convulsieve geneesmiddelen en spontane aanvallen vastgelegd in een genetisch gemodificeerde vis.
De extracellulaire methode hier gepresenteerde maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van de hersenactiviteit. Deze opnames zijn analoog aan elektro-encefalogram (EEG) monitoring vaak gebruikt om de aanwezigheid van abnormale elektrische ontlading (dat wil zeggen, in beslag) in diermodellen voor epilepsie 11 en patiënten van 12 te evalueren. Extracellulaire opnamen kunnen worden gecombineerd met farmacologische manipulaties, zoals hier getoond. Deze soorten opnamen kunnen ook worden g…
The authors have nothing to disclose.
De auteur wil Peter Castro en Matthew Dinday bedanken voor hun vroege pogingen om zebravis te vestigen in het laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health EUREKA subsidie (# R01NS079214-01).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |