Forhjerne Elektrofysiologiske Optagelse i Larvernes zebrafisk
Summary
En simpel metode til at registrere ekstracellulære feltpotentialer i larvens zebrafisk forhjerne er beskrevet. Fremgangsmåden tilvejebringer en robust<em> In vivo</em> Udlæsning af beslaglæggelse-lignende aktivitet. Denne teknik kan anvendes med genetisk modificeret zebrafisk larver bærer epilepsi-relaterede gener eller anfald fremkaldt ved indgivelse af konvulsive lægemidler.
Abstract
Epilepsi påvirker næsten 3 millioner mennesker i USA og op til 50 millioner mennesker på verdensplan. Defineret som forekomsten af spontane uprovokerede anfald, kan epilepsi kan erhverves som et resultat af en fornærmelse til hjernen eller en genetisk mutation. Bestræbelser på at model anfald hos dyr har primært udnyttet erhvervet fornærmelser (Krampestillende lægemidler, stimulering eller hjerneskade) og genetiske manipulationer (antisense knockdown, homolog rekombination eller transgenese) hos gnavere. Zebrafisk er et hvirveldyr modelsystem 1-3, der kunne give et værdifuldt alternativ til gnaver-baserede epilepsi forskning. Zebrafisk anvendes i udstrakt grad ved studiet af vertebrat genetik eller udvikling, udviser en høj grad af genetisk lighed til pattedyr og udtrykke homologer for ~ 85% af kendte humane single-gen epilepsi mutationer. På grund af deres lille størrelse (4-6 mm i længde), kan zebrafisk larver opretholdes væskevoluminer så lavt som 100 ul under tidlig udvikling og arrayed i multi-brønd plader. Reagenser kan tilsættes direkte til opløsningen hvor embryoerne udvikler, forenkle lægemiddelindgivelse og muliggør hurtig in vivo screening af testforbindelser 4. Syntetiske oligonucleotider (morpholinos), mutagenese, zinkfinger nuklease og transgene metoder kan anvendes til hurtigt at generere genet knockdown eller mutation i zebrafisk 5-7. Disse egenskaber giver zebrafisk undersøgelser en hidtil uset statistisk styrke analyse fordel i forhold til gnavere i studiet af neurologiske lidelser, såsom epilepsi. Fordi "gold standard" for epilepsi forskning er at overvåge og analysere de unormale elektriske udladninger, der stammer fra en central hjerne struktur (dvs. anfald), en metode til effektivt at registrere hjernens aktivitet i larvestadiet zebrafisk er beskrevet her. Denne metode er en tilpasning af konventionelle ekstracellulære optagelse teknikker og giver mulighed for en stabil og langsigtet overvågning af hjernens aktivitet i intakt zebrafisk larver. Srigelig optagelser er vist for akutte krampeanfald induceret af bad anvendelse af Krampestillende lægemidler og spontane anfald registreres i en genetisk modificerede fisk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ekstracellulære registreringsmetode præsenteres her muliggør en meget følsom og hurtig analyse af hjerneaktivitet. Disse optagelser er analoge med elektroencephalografisk (EEG) overvågning almindeligt anvendt til at vurdere tilstedeværelsen af abnorm elektrisk udladning (dvs. anfald) i gnavermodeller for epilepsi 11 og patienter over 12. Ekstracellulære optagelser kan kombineres med farmakologiske manipulationer, som vist her. Disse typer af optagelser kan også anvendes til at …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren vil gerne takke Peter Castro og Matthew Dinday for deres tidlige bestræbelser på at skabe zebrafisk i laboratoriet. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health EUREKA tilskud (# R01NS079214-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
Referenzen
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neurowissenschaften. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
