T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

1. 박테리아 변종과 문화 (표준 CaCl 2 치료 electroporation을 사용하여) 15 E.를 변형하여 대장균받는 셀을 (먹이, P) 엔지니어 lacZ 유전자 (표 1)의-complementation을 허용하는 플라스미드와 대장균 DH5α 세포를. 판 Luria-Bertani 한천 플레이트에 변형 세포 (LBA, 1.5 %의 한천)가 포함 된 5 – 브로 모-4 – 클로로 인돌 릴-β-D-galactopyranoside (X-여자) 40 MG / ML 최종 농도 및 적절한 항생제. ° C 하룻밤 다음과 같은 아침 (§ 1.3 참조) 푸른 transformants에 대해 선택한 37 품다. T6SS – 활성 녹농균 기증자 세포 성장 (D +) 또는 T6SS – 비활성 (D-) (표 1) 밤 LBA에 37 번 ° C. 예제에서 우리는 P.를 사용 여기에 제시된 aeruginosa의 retS가 소유 변형constitutively 활성화 H1-T6SS 16 H1-T6SS 유전자 클러스터 (표 1)의 삭제와 isogenic 돌연변이. 다음 날, E. 사이에 밝은 파란색 복제를 inoculating하여 aerated 플라스크에 밤새 액체 문화를 준비 판에서 대장균의 transformants (P)은 적절한 항생제로 보충 tryptic 간장 국물 (TSB)의 5 ML에 § 1.1에 설명되어 있습니다. 37 교반에 따라 성장 ° C. § 1.2에 설명 된 판에서 – (D) (D +) 및의 단일 식민지와 동일하게 진행합니다. 2. 경쟁 분석 다음 날 실험에 대한 LBA 판을 준비합니다. 이 플레이트가 제대로 (분젠 버너 근처 또는 층류 캐비닛에 표시) 건조되어 있는지 확인하십시오. (D -) 긴장 (D +)에 대해 "분석 – 입력"(A-입력) 판을 준비하고, (P </strong>). "검정 출력"(A-출력) 변종에 대한 판을 준비 (D – + P)와 (D + + P). 분할하고 이에 따라 번호판을 레이블을 붙입니다. 하루 아침에 성장 후 (§ 1.3 참조), 입력 세균성 문화 (D – D +와 P)의 광학 밀도 (OD 600nm)를 측정하고 각 변형의 1 단위 OD 600nm에 세포 밀도에 상응를 얻을하는 데 필요한 볼륨을 계산 . 각 "입력"세포 배양 (D – D +와 P) 처음 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브에 수집됩니다. 상온에서 1 분 동안 13,000 rpm으로 세균 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. D의 알약을 Resuspend -, D +, 및 P의 부드러운 pipetting하여 신선한 TSB의 100 μl의 문화, 그리고 각 이리와! 빨리 10 ML의 예방"A-입력"플레이트 (§ 2.1 작성)의 한 곳으로 부담을 sponding. "A-출력"판을 (§ 2.1 작성) 예방. 더 정확하게, 30 μl (P)과의 30 μl로 (D +)의 부드럽게 30 μl를 혼합 (D -) 두 개의 Eppendorf 튜브 (사용 된 문화가 § 2.4에 설명되어있는 것을주의) 30 ML (P)과 . 믹스 (D + / P)의 20 μl의 예방 및 (D – / P)의 "A-출력"판에 개별적 있습니다. 장소 근처에 분젠 버너를 건조하고 박테리아 살해가 진행되는 동안 시간의 적절한 기간 동안 37 ° C에서 보육의 판을 게재 할 수 있습니다. P.의 경우 aeruginosa는 ​​효율적인 세균 살해은 5 시간의 부화 후 T6SS 결함이있는 변형과 활성 T6SS를 비교했을 때 관찰된다. 3. t의 질적 전망대그 세균 살인 40 μg / ML 분석의 판독을위한 X-여자를 포함 LBA 판을 준비합니다. 플레이트는 "판독 입력"또는 격리 된 박테리아 또는 "판독 출력"또는 "R-출력"혼합 박테리아 문화를 파악하고 따라서 죽이는 성능을 읽을를 발견하려면 "R-입력"라고합니다. 이 번호판은 제대로 건조도 필요합니다. 그 뒤에 다른 네 동일한 부분에 금속판을 나눈다 0, 10 -1, 10 -2, 10 -3이 부분을 주석 (§ 3.3 참조) 한천 플레이트에 탐지하는 박테리아 문화의 dilutions을 지정. 희석 같은 곳에서 흰색 / 파란색 박테리아 비율의 반 정량 평가를 할 수 있습니다. "A-입력"플레이트 (§ 2.4 참조)에서 멸균 루프 개인 세균 명소와 "A-출력"플레이트 (§ 2.5 참조) 수집 및 TSB 1 ML을 포함하는 별개의 1.5 ML Eppendorf 튜브의 각 자리를 resuspend. 효율적으로 resuspend 30 분 동안 Eppendorf 흔드는 블록에 배치세균. TSB 900 μl를 포함하는 5 회 3 Eppendorf 튜브 일련의 준비와 10 -3 ~ 10 배 시리얼 dilutions까지 각 resuspended 곳으로 진행합니다. 피펫 팁을 변경하고 각 희석 단계 사이의 소용돌이 5 초에해야합니다. , undiluted 정지에 가장 희석로 시작하여 40 μg / ML X-여자를 포함 잘 말린 LBA 판에 § 3.3에서 조리하여 세균 dilutions의 야생 "A에 대한 다음의"R-​​입력 '판을 만들기 위해 진행 – 입력 "장소와"A-출력 "부분 (그림 2) R-출력"에 대한 판 ". 동질적인 세균 현탁액을 유지 야생로 이동하기 전에 잠시 소용돌이 각 관. 구역 내에 결과, 세중의에 자리 20 μl (그림 2)의 재현성하십시오. 장소는 개별적으로 접시에 분리 된 상태로 유지하고 서로를 향해 활강하지 않아도 돼 이후 판의 상대적 건조는이 단계에서 중요합니다. 경쟁 분석의 정량화는 실험이 단계에서도 가능합니다. 단계 3.3에 이어, 40 μg / ML X-여자를 포함 LBA 플레이트에 희석 10 -3 100 μl을 알리십시오. 결과의 재현성를 들어, 'A-출력 "판의 각 지점에 대한 세중의에 도금을 수행합니다. ° C 배양기 박 (16 시간의 배양에 해당) 37 년에 희석 판을 놓습니다. 푸른 식민지 (살아 남은 P 세포)의 계산을 수행합니다. 경쟁의 5 시간 후 얻은 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 각 지점에서 초과 액체의 흡수를 허용하도록 무균 지대 내의 플레이트 개방 (NO 뚜껑)를 둡니다. 밤에는 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. 이 부화 시간 동안 살인은 여전히 두 변종 접촉에 아직도 있기 때문에 (D + / P) 혼합에서 발생합니다. 사진을 찍으또는 출력 분석 (그림 2)에 대한 번호판을 검사합니다. 장소는 주로 파란색으로 남아 어디서 나타냅니다 E. 대장균은 P.에 의해 살해되지 않았습니다 aeruginosa. 그게 사건 때 E. 대장균은 T6SS – 결함이있는 P.과 혼합되어 aeruginosa 변형 (D-) (그림 2, 오른쪽 하단에있는 판).