T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi
Summary
Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.
Abstract
Kanser immünoterapi tümörleri hedef ve yok etmek için bağışıklık yanıtının özgüllüğü koşum olabilir. Genetik bir kimerik antijen reseptör (SYR) ifade etmek için değiştirilmiş T hücrelerinin evlatlık transferi dayalı evlatlık hücre tedavisi (ACT) klinik çalışmalarda 1-4 önemli olacağını göstermiştir. Orada CAR kullanarak + T hücreleri olmayan MHC kısıtlı antijenleri hedeflemek ve konak içinde homing ve sebat optimum yaşam için T hücreleri, daha işlevsel yeteneği dahil olmak üzere kanser tedavisi için çeşitli avantajları vardır; ve nihayet CAR apoptoza teşvik etmek + ana toksisite 5 durumunda T hücreleridir.
CAR optimum işlevlerini tasvir + klinik fayda ile ilişkili T hücrelerinin klinik çalışmaların yeni nesil tasarımı için önemlidir. Multiphoton mikroskopi gibi canlı hayvan görüntülemede son gelişmeler, immün hücre fonksiyonunun çalışma devrim var in vivo 6,7. Bu in vivo çalışmalar, klinik çalışmalarda T-hücresi bazlı ACT T-hücre fonksiyonlarının anlaşılmasını ederken de kullanarak, önceden infüzyon klinik etkinlik sonrası infüzyon ile T-hücresi preparatlar moleküler ve fonksiyonel özelliği bağlamak için ihtiyaç doğurur sitotoksisite ve sitokin salgılanması gibi T hücre fonksiyonlarının izlenmesi vitro tayinlerde. Standart akım sitometri dayalı testler tek hücre düzeyinde T hücre popülasyonları genel işleyişini belirlemek ancak bu konjugat oluşumu ve yaşam süreleri veya birden fazla hedeflere 8 öldürmek için aynı hücre yeteneği izlenmesi için uygun olmadığını geliştirilmiştir.
Polidimetilsiloksan (PDMS) gibi biyouyumlu polimerler dizayn Microfabricated diziler mekansal etkileyiciler ve küçük hacimleri 9 hedeflere sınırlandırmak için özellikle çekici bir yöntemdir. Otomatik time-lapse mikroskopi, tho ile birlikteefektör-hedef etkileşimlerin usands bir nanowell dizi görüntüleme bireysel kuyular tarafından aynı anda izlenebilir. Burada genel olarak T hücrelerinin sitotoksik özelliğe incelemek için uygulanabilir ve tek hücre seviyesinde T-hücre aracılı sitotoksisite izlenmesi için bir yüksek hacimli yöntem sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz nanowells diziler (Şekil 1) etkileyiciler ve hedefleri ko-kuluçka yoluyla etkin bir high-throughput tek hücreli sitolitik tahlil için protokol ana hatlarıyla. Verim ek olarak, tekniğin büyük bir avantaj da hedef hücreleri otolog ya da primer / eşlemeli tümör hücrelerinin kullanımına izin verir hedef hücre mühendisliği için gerek kalmadan istenen hedef hücrelerine karşı sitotoksisite efektör-aracılı izlemek için yeteneğidir. Uzaysal kapatılma tahlil 9 sonunda ge…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma Ödülü sayısı R01CA174385 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen bu yayında bildirdi. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
Referenzen
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
