Peptide: CMH tétramère basée sur l'enrichissement des cellules T spécifiques d'épitopes
Summary
Ce protocole décrit l'utilisation du peptide: CMH tétramères et les microbilles magnétiques pour isoler des populations de basse fréquence de cellules T spécifiques d'épitopes et les analyser par cytométrie en flux. Cette méthode permet l'étude directe des populations de cellules T endogènes d'intérêt de<em> In vivo</em> Systèmes expérimentaux.
Abstract
Une nécessité fondamentale pour les chercheurs qui étudient l'immunité adaptative avec des modèles expérimentaux in vivo est une capacité à identifier les cellules T en fonction de leur récepteur antigène des cellules T (TCR) spécificité. Nombreuses méthodes indirectes qui sont disponibles dans une population de cellules T en vrac est stimulé in vitro avec un antigène spécifique et spécifiques d'épitope des cellules T sont identifiés au moyen de la mesure d'une réponse fonctionnelle telles que la prolifération, la production de cytokine, ou l'expression de marqueurs d'activation 1. Cependant, ces méthodes seulement d'identifier l'épitope des cellules T spécifiques présentant l'une des nombreuses fonctions possibles, et ils ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter épitope des cellules T spécifiques à des fréquences précurseurs naïfs. Une alternative populaire est le modèle TCR transgénique transfert adoptif, dans lequel les cellules T monoclonaux à partir d'une souris TCR transgénique sont ensemencées dans des hôtes histocompatibles pour créer une population de précurseurs grand nombre de cellules T spécifiques d'épitopes qui peuvent être easily suivi de l'utilisation d'un anticorps marqueur congénique 2,3. Bien que puissante, cette méthode souffre d'artefacts expérimentaux liés à la fréquence non physiologique des cellules T avec une spécificité pour un seul épitope 4,5. En outre, ce système ne peut pas être utilisée pour étudier l'hétérogénéité fonctionnelle des épitopes spécifiques des clones de lymphocytes T au sein d'une population polyclonale.
Le moyen idéal pour étudier l'immunité adaptative devrait impliquer la détection directe de l'épitope des cellules T spécifiques du répertoire des cellules T endogènes en utilisant une méthode qui distingue la spécificité du TCR uniquement par sa liaison au peptide apparenté: CMH (pMHC) complexes. L'utilisation de tétramères pMHC et cytométrie de flux accomplit cette 6, mais il est limité à la détection de populations de haute fréquence de cellules T spécifiques d'épitope ne se trouvent induite par un antigène suivant l'expansion clonale. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode qui coordonne l'utilisation de tétramères pMHC et magnetic technologie d'enrichissement de cellules pour permettre la détection de cellules de fréquence extrêmement basse T spécifiques d'épitope à partir de tissus lymphoïdes de souris 3,7. Avec cette technique, on peut suivre en détail entières populations spécifiques d'épitopes de cellules T endogènes chez la souris à toutes les étapes de la réponse immunitaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le pMHC tétramère méthode basée sur l'enrichissement de cellules présenté par ce protocole est un outil puissant pour étudier épitope des cellules T spécifiques de cellules T endogènes répertoires. L'utilisation de tétramères pMHC permet la détection de cellules T spécifiques d'épitope basé directement sur la capacité de se lier à leurs TCR ligands apparentés pMHC. L'enrichissement fournit un niveau de sensibilité de telle sorte que les populations extrêmement rares de cellules T sp…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier André Han Yen-Laurent et de l'assistance technique, et les membres du laboratoire Jenkins de l'aide à l'élaboration de ce protocole.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
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