Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

1. Voorbereiding van kunstmatige cerebrospinale vloeistof en intracellulaire oplossing Voordat de proef, moet men de interne oplossing bereid voor de patch clamp opnames, evenals de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor de bereiding hippocampus. U zal bovendien behoefte aan een dissectie kit bestaande uit chirurgische schaar en fijne iris schaar, twee spatels en een pincet (Fine Science Tools), een glas vergassen apparaat (micro-filter kaars, Robu Duitsland) en weefsel net (klamboe of nylon strak), alsmede superlijm (Uhu Dent). De configuratie van de elektrofysiologie slice patch setup werd door Finkel & Bookman, 2001 1. Voor de interne oplossing opgelost (in mM): 105 K-gluconaat, 30 KCl, 10 HEPES en 0,3 EGTA in gedeïoniseerd water (in 70-80% van het uiteindelijke volume). Koel de oplossing tot 4 ° C en voeg (in mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris en 10 creatinefosfaat. Breng de pH op 7,4 met KOH en vul up met gedeïoniseerd water om het eindvolume. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtreer deze oplossing (poriegrootte 0,2 pm). Gealiquoteerd oplossing is 3-4 weken bij – 20 ° C. Voor een experimentele dag, ~ 1 ml interne oplossing nodig. Tenzij anders vermeld, de hippocampus ACSF voor bereiding en opnames van cellen in het CA1-gebied bevat (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,3 MgSO4, 1 NaH 2PO 4, 26,2 NaHCO3 en 11 glucose. Deze zouten opgelost in gedeïoniseerd water (~ osmolariteit 320 mOsm) en zuurstof deze oplossing gedurende ten minste 10 min (pH ~ 7,3 tot 7,4) met carbogen (95% O2 en 5% CO2). Bereid ten minste 1 liter oplossing per experiment. Bijzondere zorg moet worden genomen voor de bereiding van hippocampale weefsel dat wordt gebruikt om de experimenten uit te voeren in CA3 gebied van de hippocampus. Inderdaad, deze regio gekenmerkt activiteit en daaropvolgende neuronale dood epileptische. Zo synaptIC activiteit moet sterk worden verminderd tijdens slice voorbereiding, en dit wordt bereikt door het uitvoeren van de hippocampus dissectie in ijskoude sucroseoplossing bevattende (in mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 1 NaH 2PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 en 75 Sucrose Glucose. In deze oplossing, de combinatie van lage natrium, laag calcium en magnesium hoge concentraties massaal verminderen presynaptische vuren en afgifte waarschijnlijkheid evenals postsynaptische NMDA receptor activiteit, dus het minimaliseren van spontane activiteit en celdood. Na bereiding hippocampale plakken voor opnamen van cellen van het CA3 regio geperfundeerd met gemodificeerde ACSF, die 4 mM CaCl 2 en 4 MgSO4, om polysynaptic activiteit te minimaliseren. 2. Acute hippocampus Slice Voorbereiding Afkoelen ~ 300 ml van ACSF voor versnijding kamer, alsmede voor de bereiding bij 4 ° C, onder voortdurend zuurstof metcarbogen. Bereid een klein bekerglas met ACSF bij kamertemperatuur (RT) slice opslag, ook met zuurstof carbogen (Schema figuur 1). Verdoof de muis onder een kap met een klein papieren handdoek gedrenkt in 1 ml isofluraan die wordt toegevoegd in de kooi. Nadat de muis is diep verdoofd, knip de kop eraf en voeg het direct toe in een kleine schotel met ijskoude zuurstofrijk ACSF. Verwijder de hoofdhuid met een kleine schaar en breng het hoofd naar weefsel voor de volgende stappen. Beginnen de hippocampus ontleden, zoals afgebeeld en beschreven in figuur 1. Snijd 300-400 pm dikke transversale plakjes lage snelheid (3 um / sec) en trilfrequentie van 70 Hz in ijskoude zuurstof ACSF, en deze overbrengen naar een opslagruimte. Laat de plakjes rusten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur vóór opname. Plakken voor CA3 experimenten opgeslagen 25 min bij 34 ° C en ten minste 30 min bij kamertemperatuur, te herstellen van de snijproces. </ol> 3. Dual Recording van Evoked astrogliale Stromen en Neuronale Field Potentials We beschrijven hier hoe u opnemen astrogliale en neuronale responsen, dwz reacties veroorzaakt door synaps activering door afference stimulatie met behulp van een extracellulaire elektrode synaptisch-opgeroepen. Voortdurend perfuseren de opname kamer met ACSF geoxygeneerde (1.5-2 ml / min, RT), dat 100 uM picrotoxin (GABA A antagonist) aan exciterend reacties isoleren. Breng een plak op een poly-L-lysine (1,5 tot 3 mg / ml) bekleed dekglaasje, genieten de vloeistof een goede hechting slice en voeg een druppel ASCF bovenop de slice. Plaats het dekglaasje in de opname kamer. Blokkade van remmende overdracht door picrotoxin kan resulteren in epileptische activiteit, namelijk spontaan synchrone afvuren van neuronale populaties, waarbij de meting van opgewekte gebeurtenissen verstoren. Dus om epileptische activiteit te voorkomen, eenDos (alleen het oppervlak) tussen de CA1 en CA3 gebieden op de voortplantingsrichting via de Schaffer collateralen (zoals in figuur 2a) te voorkomen. Stratum radiatum astrocyten kunnen worden geïdentificeerd door hun kleine omvang soma (~ 10 micrometer) en stellatum proces montage. Kies een cel ten minste 20-30 urn onder het oppervlak slice. Monteer een glazen stimulatie-elektrode (tip weerstand ~ 1 MQ) op de zilveren draad die is aangesloten op de stimulus isolatie box en geaard op het bad (eenvoudig door het wikkelen van de tweede zilver draad rond de glazen pipet). Plaats de stimulatie-elektrode in de Schaffer zekerheid regio, zoals aangegeven in figuur 2A op een afstand van 200-300 urn afstand van de gekozen astrocyten. Monteer het gebied registratie-elektrode (~ 2-5 MQ) op een gechloreerd zilverdraad verbonden met de headstage van de versterker. Beide elektroden zijn gevuld voordat met ACSF. Kies in Multiclamp de modus I = 0, wat externe com uitgeschakeldmand ingang en plaats de elektrode ~ 50 urn afstand van de astrocyten in het stratum radiatum gebied (figuur 2A). Noteer de reacties met Gain 2 tot 10 en filter met 2 kHz Bessel filter. Elektrische stroom injectie in de hersenen slice triggers actiepotentialen in de omliggende Schaffer onderpand axonen en de daaropvolgende afgifte van transmitter op de presynaptische terminals dat project aan de postsynaptische CA1 pyramidale neuronen. De vrijgekomen zenders zal leiden tot een positieve lading stroom in de cellen door postsynaptische ionotrope-receptoren, die meetbaar extracellulair als een kleine negatieve potentiaal. Dit veld excitatoire postsynaptische potentiaal (fEPSP) integreert de activiteit van een groep gelijktijdig actief neuronen, terwijl remmende transmissie farmacologisch geblokkeerd. Breng wat stroomstoten (0,1 msec duur) om een ​​fEPSP roepen, sommige herpositionering van de stimulatie-elektrode kunnen helpen om de fEPSP te verhogen. Een typische CA1 stratum Radiatum fEPSP wordt geïllustreerd in figuur 2B. Verdere details over positionering en golfvormen reactie vindt in Yuan et al.. 2003 2. De fEPSP amplitude in een gezonde hippocampus slice moet meestal meer dan tweemaal zo groot als de amplitude van de vezel volley. Voor nauwkeurige kwantificering van fEPSP amplitude of helling moet de opgeroepen respons te monosynaptic als polysynaptic activiteit (detecteerbaar als een multi-piekrespons) geeft synaptische activiteit onafhankelijk van de elektrische stimulatie, wat een teken voor hyperexciteerbaarheid zijn. Voor experimenten in de CA3 gebied van de hippocampus zijn stimulatie als opname pipetten gepositioneerd zoals weergegeven in figuur 3C. Om duidelijk te identificeren mosvezel ingangen, die sterk vergemakkelijken, gekoppeld-puls stimulatie (50 msec interpuls interval) en 1 Hz stimulatie gedurende enkele seconden worden toegepast op massaal verbeteren van de aanvankelijk lage amplitude opgeroepen fEPSP responses.At het eindevan het experiment DCGIV een mGluR2 / 3 receptor antagonist, kan worden gewassen om verder te verifiëren dat inderdaad mosvezel inputs gestimuleerd. De toepassing van deze antagonist moet verminderen de fEPSP met ~ 90% te wijten aan de hoge expressie van mGluR2 / 3 receptoren, remmen presynaptische vrijlating uit mosvezel boutons. Vul een patch pipet (~ 2-5 MQ) met interne oplossing gefiltreerd en monteren op een gechloreerde zilverdraad met de tweede headstage toepassen positieve druk met een injectiespuit, die via slangetje om pipethouder. Voortdurend toepassen van een 20 msec testpuls van 10 mV en beweeg de pipet in het weefsel tot aan het celoppervlak en de doorbuiging van het membraan zichtbaar. Nulpuntverschuiving de pipet, verwijder de positieve druk, en klem het membraan naar – 80 mV. Wachten tot een gigaseal (ten minste 1 GΩ) bereikt (het mag niet langer dan enkele seconden). Gentle toepassing van een aantal negatieve druk zou kunnen helpen om ag te bereikenigaseal. Breken in de cel wordt bereikt door een korte toepassing van negatieve druk of met de zap functie Multiclamp. Start de gelijktijdige opname van de Schaffer onderpand opgeroepen fEPSP en de astrogliale respons in spanning klem (Vhold – 80 mV; frequentie 0,1 Hz, Bessel-filter 2 kHz, gain 10). De astrogliale huidige reactie is bifasisch: eerst zul je een snelle voorbijgaande uiterlijke huidige zie, als gevolg van fEPSPs gegenereerd door aangrenzende piramidale cellen. Dit wordt gevolgd door een langzaam stijgende en vervallen binnenwaartse stroom (aanhoudende enkele seconden (> 10 sec) na beëindiging van neuronale reacties). Deze stroom is voornamelijk te wijten aan kalium binnenkomst in astrocyten, na vrijgave door de omliggende gedepolariseerde postsynaptische terminals. Een gelijktijdig geactiveerd snel voorbijgaande glutamaat transporter stroom (GLT), veroorzaakt door presynaptische glutamaat release wordt gemaskeerd door de kalium stroom. De holding potentieel van de astrocyten, en de toegang weerstand van de pleister moet monitored gehele experiment en mag niet meer variëren dan ~ 20%, een onnauwkeurige controle van astrogliale REPONSES door veranderingen in de opnameomstandigheden voorkomen. Alleen astrocyten met een oorspronkelijke bedrijf potentieel> -70 mV moeten worden onderzocht om gezonde cellen te bestuderen. Schakelen van voltage-clamp bij lopende om de opgewekte astrocytische membraandepolarisatie nemen. Isoleer de gliale glutamaat transporter (GLT) stroom door perfusie van de ionotrope glutamaat receptor blokker kynurenic zuur (5 mM), totdat de fEPSP volledig geblokkeerd en de GLT amplitude heeft een plateau bereikt. Om duidelijk de GLT stroom, gelden de specifieke antagonist DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic zuur (DL-TBOA, 200 uM). Verhoog de stimulatie sterkte 2-voudig tot 5-voudig tot neuronale en astrogliale reacties opnemen met verschillende synaptische sterkte, en twee dicht bij elkaar gelegen stimuli (50 msec interval) toegepast om reacties te onderzoeken gepaarde puls stimulatie. Stabiliteit van de serie rWeerstand en membraanpotentiaal van de gliale cel worden gevolgd gedurende de opname. Een beeld van de omvang van de gap-junction gemedieerd astrogliale netwerken moet kleurstof koppeling experimenten worden uitgevoerd in stroomtang modus, zonder stroominjectie, van passieve diffusie van laag moleculaire kleurstoffen (<1,5 kDa), zoals sulforhodamine-B kunnen, door middel van gap junction kanalen. Om kleurstof spillover te minimaliseren in het omliggende weefsel, dient positieve druk worden toegepast door middel van de patch pipet net bij het betreden van het weefsel en de pleister moet zo snel mogelijk worden bereikt.