Preparação e inativação de patógenos de dose dupla de Buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o Sistema de Sangue INTERCEPT

1. Sangue Total Coletar sangue total de doadores voluntários em 450 ml coleção topo / fundo define de acordo com a diretrizes de coleta de sangue locais. O sangue total é armazenado durante um período mínimo de 2 horas em uma placa de arrefecimento antes da centrifugação e separação. 2. Buffy Preparação Brasão Centrifuga-se o sangue total utilizando uma rotação difícil separar o sangue em três camadas: as células vermelhas do sangue, buffy coat e plasma. Parâmetros de centrífuga foram utilizados 4880 RCF durante 11 minutos à temperatura de 22 ± 2 ° C. Utilizar um separador de sangue automatizado para expressar o plasma para dentro do saco de satélite superior e as células vermelhas do sangue (RBC) na bolsa de satélite inferior, deixando a cobertura amarelada no recipiente de recolha. Alvo significam as faixas de volume e hematócrito para casacos buffy são aproximadamente 48 ml e 37%, respectivamente. Os buffy-revestimentos são armazenadas durante a noite num agitador de plaquetas a 22 ± 2 ° C. <p class = "jove_title"> 3. Buffy Brasão Pooling Estéril de conexão 7 flogística e 300 ml de solução de aditivo SSP + plaquetas (PAS), em uma configuração comboio com linhas paralelas para reduzir o comprimento do comboio, o PAS deve estar no topo do trem. Prenda a linha entre o PAS eo revestimento buffy primeiro. Abrir as ligações entre as unidades estéreis buffy coat e permitir que o revestimento buffy escorrer para o recipiente anterior. Abrir a solda e o grampo entre a PAS e a crosta inflamatória primeiro. Permitir que um terço da solução de aditivo de lavar por meio de cada um dos recipientes de camada leuco-plaquetária sequencialmente. Repita duas vezes mais de cada vez utilizando metade da PAS restante. A média buffy coat volume da piscina deve ser aproximadamente 600 ml. Se o volume do alvo e do hematócrito dos revestimentos individuais buffy forem satisfeitas, o rácio de plasma será de 32 – 47%, conforme necessário para o tratamento de inactivação INTERCEPT patógeno mais tarde no processo. Descarte o vazio SSP + e buffyrecipientes casaco. Para a recuperação de plaquetas ideal, mantenha a piscina do agitador durante 1 hora antes da centrifugação. Estéril ligar um recipiente de armazenagem de plaquetas com filtro leucorredução integrada para a piscina buffy coat. Executar um "spin suave" do conjunto de buffy coat para separar as células vermelhas do sangue a partir das plaquetas na suspensão (462 RCF durante 9 min, 20 seg.) Expressar a suspensão de plaquetas usando um separador de sangue automatizado através do filtro leucorredução no recipiente de armazenagem de plaquetas. Os requisitos de processamento descritas anteriormente assegurar que a suspensão de plaquetas satisfaz as especificações de processamento INTERCEPT de 300 ml – 420 ml de volume, 2,5-7,0 x 10 11 dose de plaquetas, e ≤ a 4 x 10 6 / ml de glóbulos vermelhos. 4. INTERCEPTAR Tratamento Realizar o tratamento INTERCEPT antes do final do 1 º dia após a coleta (dia 0 é o dia da coleta). Desembrulhe o Conjunto de Processamento INTERCEPTcom recipientes de armazenamento dupla da bolsa de plástico transparente. Conectar o recipiente estéril suspensão de plaquetas aos tubos do recipiente amotosalen sobre o conjunto de processamento INTERCEPT. Rotular a interceptação de processamento de recipientes de armazenamento conjunto com a identificação adequada de sangue produto seguindo as exigências locais. Pendurar as plaquetas e quebrar primeiro a cânula inferior no recipiente amotosalen, permitindo que a solução amotosalen flua para o recipiente de iluminação. Quebrar a cânula de topo no recipiente amotosalen permitindo que as plaquetas a fluir através do recipiente para o recipiente amotosalen iluminação. Misturar cuidadosamente a mistura de plaquetas e amotosalen e expressar o ar a partir do recipiente para o recipiente de iluminação amotosalen. Expressam uma pequena quantidade da mistura de plaquetas à tubagem, enchendo cerca de 4 cm da tubagem. Isto assegura plaquetas em ambos os tubos e submeter-se ao recipiente de iluminação inactivati ​​patógenoem tratamento. Selar o tubo entre o recipiente de iluminação e do recipiente amotosalen. Deixar não mais do que cerca de 4 cm de tubo que se prolongam a partir do recipiente de iluminação. Retire e descarte a plaquetas e recipientes vazios amotosalen e fechar os grampos nas bolsas de amostragem. Colocar o conjunto de processamento para o iluminador com o recipiente de iluminação no compartimento grande no lado esquerdo e do organizador no compartimento mais pequeno, no lado direito. Use o dispositivo de código de barras de mão para inserir a ID doação, código do produto, número de lote e processamento conjunto para o iluminador. Feche a tampa de metal e, quando solicitado na interface gráfica iluminador, fechar a gaveta. Pressione o botão "Iniciar" para iniciar a Iluminação. Depois de iluminação, retirar o conjunto de processamento a partir do iluminador. O iluminador imprime automaticamente o relatório para a unidade de tratamento tratados com plaquetas (s). Desembrulhar os recipientes do organizador e pendurar a platelets e conjunto de processamento, quebrar a cânula na saída do recipiente de iluminação, e permitir que as plaquetas a fluir para dentro do dispositivo composto de adsorção (CAD) do recipiente. Tomando cuidado para não dobrar o wafer CAD, expressar o ar a partir do recipiente para o recipiente CAD iluminação utilizando um extractor de plasma. Selar o tubo, próximo da abertura de entrada do recipiente de CAD. Retire e descarte o recipiente vazio iluminação. Colocar o recipiente de CAD com os recipientes de armazenamento conectados em um agitador de plaquetas, pelo menos, 6 horas, mas não mais de 16 horas. Isto irá resultar na redução da amotosalen residual a uma concentração de ≤ 2 uM. Após o tratamento da DAC, remover as unidades de plaquetas a partir do agitador. Pendure as plaquetas. Quebrar a cânula e permitir que as plaquetas a fluir para os recipientes de armazenamento. Exprime-se o ar a partir dos recipientes de armazenamento para o recipiente de CAD. Deixe que a parte de trás do fluxo residual concentrado de plaquetas nos recipientes de armazenamento,gravidade. Selar o tubo acima da Y-encaixe e remova o recipiente vazio CAD. Volume de redistribuir entre os recipientes de armazenamento, conforme necessário. Os ajustes de volume são feitas através da pesagem dos recipientes de armazenamento. Selar o tubo em cada recipiente de armazenamento de alguns centímetros acima da entrada do recipiente de armazenamento, o que facilita a obtenção de uma amostra estéril do produto final, tal como descrito em 5.2. 5. Amostragem produto Para os testes de rotina QC, os recipientes de armazenamento final pode ser amostrada uma vez, utilizando o saco de amostragem nos recipientes de armazenamento. Para fazer isso, assegurar que a unidade de plaquetas é bem misturada e, em seguida abrir o grampo para a bolsa e apertar várias vezes. Selar o tubo após a bolsa ter enchido com as plaquetas. Transfira a amostra das plaquetas para um tubo de laboratório adequado e realizar ensaios de imediato. Para obter amostras em múltiplos pontos temporais ao longo de armazenamento, tal como um estudo de validação, conectar estérilum recipiente de amostragem de novo para o tubo do recipiente de armazenagem de plaquetas. Certifique-se de que as plaquetas são bem misturados antes de serem transferidos para o recipiente de recolha. 6. Avaliação in vitro da função Para este estudo de validação, a avaliação in vitro foi realizada após CAD tratamento (Dia 1 ou Dia 2, dependendo da duração CAD) e novamente no Dia 4 (ou 5 º dia) e no dia 7. Em medições in vitro incluiu volume, a contagem de plaquetas, pH, gás de sangue (PO 2, PCO 2), glicose, lactato, e rodando. O volume foi determinado pelo peso, utilizando 1,01 g / ml, tal como a gravidade específica de plaquetas na solução de aditivo. Contaminação da hemoglobina foi avaliado visualmente por comparação com uma escala de cores. Roda foi determinada visualmente. Consulte "Tabela de equipamentos" para a metodologia de outros ensaios. 7. Resultados representativos O processo de produção de double dose de buffy coat plaquetas inicia-se com a produção de revestimentos individuais buffy que satisfazem as especificações de destino para o volume e o hematócrito. Como não é prático para medir o hematócrito do indivíduo flogística durante o processo de validação final, começou a realizar um esforço separado para otimizar a nossa buffy casacos para garantir que poderiam atender de forma consistente volume alvo e hematócrito. Como mostrado na Tabela 1, os casacos optimizado buffy comparados favoravelmente com os valores alvo para o volume e hematócrito a 46 ± 2 mL e 37 ± 3%, respectivamente. Depois de partilha, o volume do hematócrito e da piscina buffy coat deve ser de aproximadamente 600 ml e 20%, respectivamente, antes da centrifugação, rotação suave. Como ilustrado na Tabela 2, os conjuntos de buffy coat em média 615 ± 5 ml, o hematócrito em média de 19 ± 1%. Os resultados de spin suaves centrifugação em um conc dose dupla de plaquetasEntrate que preencham os requisitos de entrada para a inativação de patógenos que utilizam o Sistema de Sangue INTERCEPT DS conjunto de processamento. Parâmetros de entrada chave para o tratamento INTERCEPT incluem contagem, volume de plaquetas, plasma relação e conteúdo RBC. Além disso, pretende-se recuperar ≥ 75% das plaquetas no concentrado de plaquetas, em comparação com o pool de buffy coat. Por exigências locais, a contaminação de glóbulos brancos (WBC) deve ser <1×10 6 / unidade. O concentrado de plaquetas na nossa validação preencheram os parâmetros chave para o tratamento INTERCEPT, bem como os alvos de WBC contaminação e recuperação das plaquetas, como mostrado na Tabela 3. O processo de inactivação de agentes patogénicos INTERCEPT é executada no concentrado de dose dupla de plaquetas utilizando um conjunto único de processamento INTERCEPT. O conjunto de processamento contém dois recipientes de armazenamento integrado que permitem que a unidade tratada para ser dividida em duas doses individuais terapêuticas de plaquetas após a conclusão do caminhoOgen processo de inativação. Orientações europeias exigem que 75% das unidades testadas contêm ≥ 200×10 9 plaquetas por terapêutica dose1; requisitos locais na Suécia exigem que 75% das unidades testadas contêm> 240×10 9 plaquetas por dose. Após o tratamento INTERCEPT, o teor médio de plaquetas foi de 265 ± 22 x10 9 (n = 24). Além disso, 88% das unidades alcançado ou ultrapassado 240×10 9 plaquetas por dose terapêutica, o que está bem dentro de ambas as diretrizes e regulamentos europeus suecos. Veja as Figuras 1 e 2 para uma ilustração da dupla preparação casaco dose de Buffy e processos INTERCEPT tratamento, respectivamente. Para esta validação, medimos o em características in vitro do concentrado de plaquetas após o tratamento INTERCEPT (isto é, após a separação entre os recipientes de armazenamento individuais); parâmetros foram medidos ao longo de 7 dias de armazenamento. A média eo desvio-padrão foram coletadas paradosagem de plaquetas, pH, PO 2, PCO 2, a produção de lactato e consumo de glicose. A Figura 3 mostra a média de uma dose inicial de plaquetas do concentrado de plaquetas dose dupla antes do tratamento INTERCEPT e a dose média de plaquetas em cada um dos produtos da divisão após tratamento INTERCEPT ao longo de 7 dias de armazenamento. Perda de plaquetas durante a armazenagem foi de aproximadamente 9%. Essa redução não é diferente da esperada perda de plaquetas durante a armazenagem de plaquetas convencionais. 2 A Tabela 4 resume as características in vitro em plaquetas dos INTERCEPT após o tratamento e dividindo-se em unidades individuais. Por requisitos europeus, o pH de plaquetas deve ser superior a 6,4 através do fim da vida útil de prateleira. Durante o processamento, o pH do concentrado de plaquetas cai um pouco dependendo da concentração de plaquetas, volume, e a permeabilidade ao gás do sto plaquetáriarecipiente raiva. Figura 4 ilustra o pH dos produtos da divisão de plaquetas ao longo de 7 dias de armazenamento. Durante o armazenamento, o pH é mantido estável e bem dentro das exigências de processamento. Como mostrado nas Figuras 5A e 5B, o consumo de O2 de plaquetas e produção de CO 2 indicam a respiração continuada pelas plaquetas intercepto no recipiente PL2410 durante 7 dias de armazenamento. Figuras 6A e 6B mostram os níveis de lactato e de glucose, ao longo de 7 dias de armazenamento . O consumo de glucose e produção de lactato de plaquetas são consistentes com o outro, durante os 7 dias de armazenamento. 5 unidades tinham níveis de glicose inferior a 1,11 mmol / l (o limite inferior para o doseamento de glucose). A preparação buffy coat e plaquetas validação agrupamento produzido concentrados que preencheram os critérios de entrada para tratamento INTERCEPT, especificamente, volume, contagem de plaquetas, plasma relação, e vermelho blood contaminação celular. As unidades finais preencheram os critérios de validação ao longo de 7 dias de armazenamento, incluindo a dose de plaquetas e pH. Parâmetro Target Range Resultados A média ± DP Volume (ml) ~ 48 46 ± 2 Hematócrito (%) ~ 37 37 ± 3 Tempo de espera antes de partilha Pernoite em agitador Pernoite em agitador Tabela 1. Características do indivíduo Buffy Coats (n = 19). Parâmetro Target Range Resultados A média ± DP Volume (ml) ~ 600 615 ± 5 Hematocrit (%) ~ 20 19 ± 1 Tempo de espera antes da centrifugação 1 hora em agitador 1 hora em agitador Tabela 2. Características das Piscinas Buffy Coat (n = 12). Parâmetro Alvo Resultados A média ± DP Volume (ml) 370-420 404 ± 8 A contagem de plaquetas (x10 9 / unidade) 250-700 577 ± 62 A média de recuperação de plaquetas (%) ≥ 75 75 ± 4 Plasma proporção (%) 32-47 38 ± 1 RBC (x10 6 / ml) ≤ 4 1,2 ± 0,4 WBC (x10 6 </saté> Unidade /) ≤ 1 0,11 ± 0,1 Tempo de espera antes da Interceptação (hr) ≤ final do dia 1 ≤ final do dia 1 Tabela 3. Características da Plaquetas Double-Dose Concentrados (n = 12). Média ± DP Min Max Volume (ml) 199 ± 16 182 236 A contagem de plaquetas (x10 9 / unidade) 265 ± 22 225 292 pH (22 ° C) 6,9 ± 0,1 6,8 7 pO 2 (kPa) 21,4 ± 4,8 12,8 27,3 pCO 2 (kPa) 4,3 e plusmn, 0,4 3,3 4,9 De lactato (mmol / l) 9,1 ± 1,7 6,8 12,4 Glucose (mmol / l) 5,3 ± 0,9 3,7 6,5 Tabela 4. Características do INTERCEPT Dia plaquetas tratadas 1/2 (em unidades individuais, n = 24). Figura 1. Produção de um concentrado duas vezes a dose de plaquetas a partir de um pool de 7 flogística. Figura 2. Inativação de patógenos de um concentrado de plaquetas dose dupla com o Sistema de Sangue INTERCEPT. Figura 3. A dose média de plaquetas antes e durante7 dias após o tratamento INTERCEPT (n = 12 antes INTERCEPT, n = 24 depois INTERCEPT). Figura 4. A média ± DP de pH de plaquetas após INTERCEPT tratamento (n = 24). Figura 5A. Média ± SD pO 2 INTERCEPT após tratamento (n = 24). Figura 5B. Média ± SD pO 2 INTERCEPT após tratamento (n = 24). Figura 6a. Níveis médios de lactato ± DP depois da interceptação de tratamento (n = 24). Figura 6B. Os níveis médios de glicose &plusmn; SD após o tratamento INTERCEPT (n = 24).