Préparation et inactivation des agents pathogènes des doubles produits Buffy Coat dose de plaquettes à l'aide du système sanguin INTERCEPT

1. Collection de sang total Prélever le sang entier de donneurs volontaires dans 450 ml haut / bas de collecte fixe en fonction de règles locales de collecte de sang. Le sang entier est stocké pendant au moins 2 heures sur une plaque de refroidissement avant la centrifugation et la séparation. 2. Préparation Buffy Coat Centrifuger le sang total en utilisant un spin difficile de séparer le sang en trois couches: les globules rouges appauvri en leucocytes et le plasma. Centrifugeuse paramètres utilisés étaient 4.880 RCF pendant 11 min à 22 ± 2 ° C. Utiliser un séparateur de sang automatisé pour exprimer le plasma dans la poche satellite haut et les globules rouges (RBC) dans la poche satellite bas, laissant la couche leuco-plaquettaire dans le récipient de collecte. Cibler signifie gammes de volumes et de l'hématocrite pour couches leucocytaires sont d'environ 48 ml et 37%, respectivement. Les leuco-couches sont conservés pendant une nuit sur un agitateur de plaquettes à 22 ± 2 ° C. <p class = "jove_title"> 3. Buffy Coat mise en commun Stérile Connect 7 buffy coats et 300 ml de SSP + solution additive plaquettaire (PAS) dans une configuration de train avec des lignes parallèles afin de réduire la longueur du train, le PAS doit être au dessus du train. Fixer la ligne entre le PAS et la première couche leuco-plaquettaire. Ouvrez les connexions stériles entre les unités de couche leuco-plaquettaire et permettre au manteau buffy s'écouler dans le dernier conteneur. Ouvrez la soudure et la pince entre le PAS et la première couche leuco-plaquettaire. Permettre un tiers de la solution additive à rincer à travers chacun des récipients de couche leucocytaire séquentiellement. Répéter 2 fois plus de temps à l'aide de chaque moitié restante du PAS. Le volume moyen buffy coat piscine doit être d'environ 600 ml. Si le volume cible et de l'hématocrite des couches leucocytaires individuelles sont respectées, le ratio plasma sera de 32 à 47% selon les besoins pour le traitement d'inactivation des pathogènes INTERCEPT tard dans le processus. Jeter le vide SSP + et buffyconteneurs manteau. Pour la récupération des plaquettes optimales, la piscine sur l'agitateur pendant 1 h avant la centrifugation. Stérile connecter un conteneur de stockage de plaquettes avec filtre intégré la réduction leucocytaire à la piscine de la couche leucocytaire. Effectuer un "mouvement rotatif doux" de la piscine de la couche leucocytaire pour séparer les globules rouges à partir des plaquettes en suspension (462 RCF pendant 9 min, 20 sec). Exprimer la suspension de plaquettes à l'aide d'un séparateur de sang automatisé par l'intermédiaire du filtre de leucoréduction dans le récipient de stockage des plaquettes. Les exigences de traitement décrites précédemment veiller à ce que la suspension de plaquettes est conforme aux spécifications de traitement INTERCEPT de 300 ml – 420 ml de volume, de 2,5 à 7,0 x 10 11 plaquettes de dose et ≤ 4 x 10 6 / ml de globules rouges. 4. INTERCEPT traitement Effectuer le traitement INTERCEPT avant la fin du jour 1 après la collecte (jour 0 est le jour de la collecte). Déballez le kit de traitement INTERCEPTavec les réservoirs de stockage double de la pochette en plastique transparent. Connecter le récipient stérile suspension de plaquettes de la tubulure du récipient amotosalen sur le poste de traitement INTERCEPT. Étiqueter les contenants de traitement INTERCEPT ensemble de stockage avec l'identification du produit sanguin approprié selon les exigences locales. Accrocher les plaquettes et rompre la canule premier fond sur le récipient amotosalen, permettant à la solution amotosalen à s'écouler dans le récipient d'éclairage. Rompre la canule sur le récipient supérieur amotosalen permettre aux plaquettes de s'écouler à travers le récipient dans le récipient amotosalen illumination. Mélanger doucement le mélange de plaquettes et amotosalen et exprimer l'air du récipient dans le récipient d'éclairage amotosalen. Exprimer une petite quantité du mélange des plaquettes dans le tube, de remplissage d'environ 4 cm de la tubulure. Cela garantit plaquettes dans les tubes et conteneurs éclairage subir l'agent pathogène inactivatisur le traitement. Sceller le tuyau entre le réservoir et le récipient d'éclairage amotosalen. Laisser pas plus d'environ 4 cm de tube s'étendant à partir du récipient d'éclairage. Retirez et jetez la plaquette contenants vides amotosalen et fermer les pinces sur les sachets d'échantillonnage. Placer l'ensemble de traitement dans le dispositif d'éclairage avec le récipient d'éclairage dans le grand compartiment sur la gauche et l'organisateur dans le petit compartiment sur le côté droit. Utilisez le code-barres dispositif tenu à la main pour saisir l'ID don, code produit, numéro de lot et le traitement des jeux dans l'illuminateur. Fermez le couvercle de métal et lorsque vous êtes invité sur l'interface graphique d'éclairage, fermer le tiroir. Appuyez sur "Start" pour lancer l'illumination. Après illumination, retirez l'ensemble de traitement de l'illuminateur. L'illuminateur imprime automatiquement le rapport de l'unité de traitement de plaquette traité (s). Déballez les conteneurs de l'organisateur et accrocher le platelets et poste de traitement, rompre la canule au niveau de la sortie du récipient d'éclairage, et permettre aux plaquettes de s'écouler dans le dispositif composé d'adsorption (CAD) récipient. Prendre soin de ne pas plier la plaquette CAD, exprimer l'air du récipient CAD dans le récipient éclairage utilisant un extracteur de plasma. Sceller le tube à proximité de l'orifice d'entrée du récipient de CAO. Retirer et jeter le contenant vide éclairage. Placez le récipient CAD avec les conteneurs de stockage connectés sur un agitateur de plaquettes pendant au moins 6 heures, mais pas plus de 16 heures. Il en résultera une diminution de amotosalen résiduel à une concentration de ≤ 2 pM. Après le traitement CAO, retirez les unités de plaquettes de l'agitateur. Accrochez les plaquettes. Rompre la canule et permettre plaquettes de s'écouler dans le conteneur de stockage. Exprimer l'air à partir des récipients de stockage dans le récipient de CAO. Laissez le dos des plaquettes de flux résiduel concentré dans les conteneurs de stockage pargravité. Sceller le tube au-dessus du raccord en Y et retirez le récipient vide CAD. Redistribuer le volume entre les récipients de stockage en fonction des besoins. Réglage du volume est faite par pesée des conteneurs de stockage. Sceller le tube à chaque récipient de stockage de quelques centimètres au-dessus de l'orifice d'entrée du récipient de stockage, ce qui facilite l'obtention d'un échantillon stérile du produit final, comme décrit dans 5,2. 5. Échantillonnage des produits Pour les tests de contrôle qualité de routine, les conteneurs de stockage définitifs peuvent être échantillonnées une fois à l'aide de la poche d'échantillonnage sur les récipients de stockage. Pour ce faire, s'assurer que l'appareil est bien mélangé plaquettes, puis ouvrez la pince à la poche et presser plusieurs fois. Sceller le tube après le sachet rempli de plaquettes. Transférer l'échantillon dans un tube de plaquettes de laboratoire appropriées et d'effectuer des essais immédiatement. Pour obtenir des échantillons à différents moments au cours du stockage, comme par une étude de validation, connectez stérileun récipient d'échantillonnage à nouveau le tube du récipient de stockage des plaquettes. Faire en sorte que les plaquettes sont bien mélangés avant le transfert au récipient d'échantillonnage. 6. Fonction d'évaluation in vitro Pour cette étude de validation, évaluation in vitro a été réalisée après le traitement CAD (Jour 1 Jour 2 ou, selon le CAD durée) et de nouveau le Jour 4 (ou le jour 5) et le jour 7. Mesures in vitro inclus volume, numération plaquettaire, le pH, gaz du sang (pO 2, pCO 2), le glucose, le lactate, et tourbillonnant. Le volume a été déterminé par le poids en utilisant 1,01 g / ml comme le poids spécifique des plaquettes dans une solution additive. Contamination d'hémoglobine a été évaluée visuellement à l'aide par rapport à un nuancier. Tourbillonnant a été déterminée visuellement. Voir le "Tableau de matériel" pour la méthodologie des tests d'autres. 7. Les résultats représentatifs Le procédé de production double dose couche leuco-plaquettaire des plaquettes commence avec la production de couches leucocytaires individuels qui répondent aux spécifications cibles pour le volume et l'hématocrite. Comme il n'est pas pratique de mesurer l'hématocrite de l'individu couches leuco-plaquettaire lors de la validation du procédé final, nous avons commencé par entreprendre une activité visant à optimiser notre buffy coats pour s'assurer que nous pourrions rencontrer régulièrement volume cible et de l'hématocrite. Comme le montre le tableau 1, nos optimisés couches leucocytaires se compare favorablement avec les valeurs cibles à la fois du volume et de l'hématocrite à 46 ± 2 ml et 37 ± 3%, respectivement. Après la mise en commun, le volume et de l'hématocrite de la couche leuco-plaquettaire piscine doit être d'environ 600 ml et 20%, respectivement, avant la centrifugation mouvement rotatif doux. Comme l'illustre le tableau 2, nos piscines couche leuco-plaquettaire moyenne de 615 ± 5 ml; l'hématocrite moyenne de 19 ± 1%. Les résultats douces de centrifugation de spin dans un concentré plaquettaire double doseentrate qui répondra aux exigences d'entrée pour l'inactivation des pathogènes en utilisant le système INTERCEPT sang DS traitement ensemble. Principaux paramètres d'entrée pour le traitement INTERCEPT comprennent le volume, la numération plaquettaire, taux plasmatique, et le contenu de RBC. En outre, nous cherchons à récupérer ≥ 75% des plaquettes dans le concentré de plaquettes par rapport au pool de couches leuco. Conformément aux exigences locales, le globule blanc du sang (WBC) la contamination doit être <1×10 6 / unité. Le concentrés plaquettaires dans notre validation a rencontré les principaux paramètres de traitement INTERCEPT ainsi que les objectifs de la contamination WBC et la récupération plaquettaire, comme indiqué dans le tableau 3. Le processus INTERCEPT pour l'inactivation des agents pathogènes est réalisée sur le concentré plaquettaire dose double en utilisant un ensemble unique de traitement INTERCEPT. L'ensemble de traitement comporte deux réservoirs de stockage intégrés qui permettent à l'unité de traitement pour être divisé en deux doses thérapeutiques individuelles des plaquettes à la fin du trajetprocessus d'inactivation du fibrinogène. Directives européennes exigent que 75% des unités testées contiennent ≥ 200×10 9 plaquettes par dose1 thérapeutique, des exigences locales en Suède exigent que 75% des unités testées contiennent> 240×10 9 plaquettes par dose. Après le traitement INTERCEPT, la teneur moyenne en plaquettes était de 265 ± 22 x10 9 (n = 24). En outre, 88% des unités atteint ou dépassé 240×10 9 plaquettes par dose thérapeutique, ce qui est bien dans les deux directives et règlements européens suédois. Voir les figures 1 et 2 pour une illustration de la préparation couche leuco-plaquettaire double dose et procédés de traitement INTERCEPT respectivement. Pour cette validation, nous avons mesuré le caractéristiques in vitro de la concentrés de plaquettes INTERCEPT après le traitement (après la scission dans les conteneurs de stockage individuels), les paramètres ont été mesurés sur 7 jours de stockage. Moyenne et l'écart type ont été recueillies pourdose de plaquettes, le pH, pO 2, pCO 2, la production de lactate et de la consommation de glucose. La figure 3 montre la moyenne de la dose initiale du concentré plaquettaire double dose de plaquettes avant traitement INTERCEPT et la dose moyenne de plaquettes dans chacun des produits fractionnés après le traitement INTERCEPT plus de 7 jours de stockage. Perte de plaquettes pendant le stockage était d'environ 9%. Cette réduction n'est pas différent de la perte attendue des plaquettes pendant le stockage des plaquettes conventionnelles 2. Le tableau 4 résume les caractéristiques in vitro sur des plaquettes INTERCEPT après le traitement et la séparation en unités individuelles. Conformément aux exigences européennes, le pH des plaquettes doit rester au-dessus de 6.4 à la fin de la durée de vie. Au cours du traitement, le pH de la concentrés de plaquettes diminue légèrement en fonction de la concentration des plaquettes, le volume et la perméabilité aux gaz de la plaquette de storécipient rage. Figure 4 illustre le pH des produits fractionnés de plaquettes de plus de 7 jours de stockage. Pendant le stockage, le pH est stable et bien maintenue dans les conditions de traitement. Comme le montre les figures 5A et 5B, la plaquette consommation d'O 2 et de la production de CO 2 indiquent la respiration poursuivi par les plaquettes INTERCEPT dans le conteneur PL2410 pendant 7 jours de stockage. Figures 6A et 6B montrent les taux de lactate et de glucose de plus de 7 jours de stockage . La consommation de glucose et la production de lactate plaquettes sont compatibles les uns avec les autres pendant les 7 jours de stockage. 5 unités avaient un niveau de glucose inférieur à 1,11 mmol / l (la limite inférieure pour le dosage du glucose). La préparation de la couche leucocytaire et plaquettaire de validation mise en commun des concentrés produits qui répondaient aux critères d'entrée pour le traitement INTERCEPT, plus précisément, le volume, la numération plaquettaire, taux plasmatique et rouge blcontamination par les cellules ood. Les unités finales rencontré les critères de validation de plus de 7 jours de stockage, y compris dose de plaquettes et le pH. Paramètre Fourchette cible Résultats La moyenne ± écart-type Volume (ml) ~ 48 46 ± 2 Hématocrite (%) ~ 37 37 ± 3 Tenez temps avant la mise en commun Nuit sur l'agitateur Nuit sur l'agitateur Tableau 1 Caractéristiques. Manteaux de l'individu Buffy (n = 19). Paramètre Fourchette cible Résultats La moyenne ± écart-type Volume (ml) ~ 600 615 ± 5 Hematocrit (%) ~ 20 19 ± 1 Le temps de maintien avant centrifugation 1 heure sur agitateur 1 heure sur agitateur Tableau 2 Caractéristiques. Des Fonds couche leuco-plaquettaire (n = 12). Paramètre Cible Résultats La moyenne ± écart-type Volume (ml) 370 à 420 404 ± 8 Numération plaquettaire (x10 9 / unité) 250 à 700 577 ± 62 Taux de récupération moyen des plaquettes (%) ≥ 75 75 ± 4 Rapport plasma (%) 32 à 47 38 ± 1 RBC (x10 6 / ml) ≤ 4 1,2 ± 0,4 WBC (x10 6 </sup> / unité) ≤ 1 0,11 ± 0,1 Tenez temps avant INTERCEPT (h) ≤ fin du jour 1 ≤ fin du jour 1 Caractéristiques Tableau 3. Du plaquettaire double dose Concentrés (n = 12). Moyenne ± SD Min Max Volume (ml) 199 ± 16 182 236 Numération plaquettaire (x10 9 / unité) 265 ± 22 225 292 pH (22 ° C) 6,9 ± 0,1 6,8 7.0 pO 2 (kPa) 21,4 ± 4,8 12,8 27,3 pCO 2 (kPa) 4.3 & jusmn, 0,4 3,3 4,9 Lactate (mmol / l) 9,1 ± 1,7 6,8 12,4 Glucose (mmol / l) 5,3 ± 0,9 3,7 6,5 Caractéristiques Tableau 4. Du jour INTERCEPT plaquettes traitées 1/2 (unités uniques, n = 24). Figure 1. Production d'un concentré plaquettaire double dose d'un pool de 7 couches leucocytaires. Figure 2. Inactivation des agents pathogènes d'un concentré plaquettaire double dose avec le système sanguin INTERCEPT. Figure 3. La dose moyenne plaquettes avant et pendant7 jours après le traitement INTERCEPT (n = 12 avant INTERCEPT, n = 24 après INTERCEPT). Figure 4. PH moyen ± écart-type plaquettaire après le traitement INTERCEPT (n = 24). La figure 5A. Moyenne ± écart-type pO 2 après le traitement INTERCEPT (n = 24). La figure 5B. Moyenne ± écart-type pO 2 après le traitement INTERCEPT (n = 24). La figure 6A. Moyenne ± écart type des taux de lactate après le traitement INTERCEPT (n = 24). La figure 6B. Moyenne des niveaux de glucose etplusmn; SD après le traitement INTERCEPT (n = 24).