De procéder au lavage vaginal, coloration au cristal violet et l'évaluation cytologique vaginal pour Souris cycle œstral Staging identification

1. Réactifs Préparation Pour un lavage vaginal stérile, autoclave eau bidistillée (ddH 2 O) et conserver dans un contenant hermétique à la température ambiante jusqu'au moment de servir. Pour l'évaluation cytologique, ajouter 0,1 g de poudre de cristal violet à 100 ml de ddH 2 O. Mélangez bien. Cristal violet tache (0,1%) peut être conservé dans un récipient hermétique à température ambiante jusqu'à ce que nécessaire. 2. Collecte des cellules vaginales (lavage vaginal) Monter une ampoule de latex sur la fin d'une pointe stérile 200 ul et d'établir environ 100 ul d'eau stérile ddH 2 O en utilisant les graduations sur le bout de ligne directrice volume. Soulevez la souris hors de sa cage et la placer sur la trémie cage (couvercle) avec son arrière-train / arrière vers vous. Saisir fermement la queue et élever l'extrémité arrière. La souris sera désormais seulement ses pattes avant saisie de la trémie. A ce stade, la souris peut uriner. Si c'est le cas, Attendez jusqu'à l'arrêt de la miction. Faut-il urine gauche à l'entrée du canal vaginal, vous pouvez rincer l'ouverture avec un excès de O 2 en utilisant ddH une pointe distincte (c'est à dire pas le bout de votre prélèvement de l'échantillon). Placer l'extrémité de la ddH 2 O-remplie pointe à l'ouverture du canal vaginal en prenant soin de ne pas pénétrer dans l'orifice vaginal comme (et du col) peut induire une stimulation pseudogestation chez le rat 1,2. Des rapports récents suggèrent souris sont moins sensibles à cet effet néanmoins des précautions doivent être prises pour minimiser le degré d'envahissement dans les analyses répétées 3. Enfoncer doucement l'ampoule pour expulser quart-moitié du volume d'eau (~ 25-50 pi) à l'ouverture de canal vaginal. Le liquide spontanément aspirer dans le canal sans pointe d'insertion. Relâcher lentement la pression exercée sur l'ampoule. Le liquide se replier dans la pointe. Évitez de libération de pression trop rapidement pour prévenir l'aspiration de liquidedans l'ampoule. Un conseil filtrée peut être utile à cet effet. Répétez les étapes précédentes fois 4-5, en utilisant le même embout, ampoule, et fluide pour obtenir un nombre suffisant de cellules dans un seul échantillon. Placez le fluide sur lame de verre, et de permettre le frottis sécher complètement à température ambiante. Une fois sec, ces frottis oestrus peut être teinté immédiatement ou stockées et colorées à une date ultérieure. 3. La coloration cytologique l'aide de Crystal Violet * 4 Placer la lame à sec dans un bocal Coplin (ou un autre récipient coloration comparable) contenant le cristal violet coloration pendant 1 min. Enlever à un deuxième pot Coplin contenant ddH 2 O. Laver la lame avec ddH 2 O pendant 1 min. Répéter. Retirer l'excédent ddH 2 O à partir des bords de la lame avec un tissu d'essuie-glace légers, en évitant le contact avec le frottis coloré. Pipeter environ 15 ul de glycérol sur le dessus du frottis et le couvercleglisser. Alternativement, d'autres réactifs histologiques de montage peut être utilisé pour obtenir un plus permanent, non diffusant tache. * La méthode de coloration décrite ici est la procédure la plus simple qui peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire. D'autres méthodes peuvent fournir des détails supplémentaires. Par exemple, en utilisant une coloration de Papanicolaou, la maturité des cellules épithéliales nucléées peuvent être distingués avec des cellules colorées turquoise moins matures et plus cellules matures rose ou orange-colorés. Ces différences peuvent être utilisés pour organiser proestrus tôt ou tard 4. 4. Cytologie vaginale Examiner le frottis au microscope optique pour déterminer les types cellulaires présents. L'examen microscopique doit être effectué immédiatement après la coloration comme le cristal violet va diffuser à partir des cellules au cours du temps lors de l'utilisation du glycérol pour recouvrement. Microphotographies doivent être prises au moment de l'analyse pour documenter la cytologie. Commençons par examiner le entire frottis à un faible grossissement. Sélectionnez une zone représentative et passer à un plus fort grossissement. Vous verrez cornified cellules épithéliales squameuses, leucocytes et / ou nucléées cellules épithéliales (résultats représentatifs, figure 1A-C). Le rapport présente des cellules vous permettra de déterminer le stade oestrus de votre souris au moment du prélèvement des échantillons (résultats représentatifs, figure 1D-G) et son statut hormonal immédiat (discussion, figure 2). 5. Les résultats représentatifs Cytologie: Trois types de cellules primaires peuvent être détectés dans des échantillons de frottis vaginaux: (1) nucléés cellules épithéliales (Figure 1A), (2) cornified cellules épithéliales squameuses (figure 1B), et (3) des leucocytes (figure 1C). Nucléées cellules épithéliales ont un cytoplasme légèrement teinté, plus sombre teinté membrane plasmique, et un noyau ovale ( <strong> Figure 1A). Cornified cellules épithéliales squameuses sont uniformément colorées, plus de forme polygonale que leurs prédécesseurs nucléées épithéliales, et n'ont pas de noyau (figure 1B). Leucocytes polynucléaires peuvent être distinguées des cellules épithéliales par leur forme irrégulière, sombre et teinté noyaux polymorphes, et de petite taille (figure 1C, flèches noires). En cas de contamination d'urine être présents dans le frottis, cristaux d'acide urique sont facilement détectés par leurs structures cristallines différentes à tous les types de cellules attendus (figure 3). Si cela se produit, et la détection obscure de type cellulaire prédominant, le frottis doit être jeté et ne pas utiliser pour des fins de mise en scène. Mise en scène: Le rapport relatif des types cellulaires observées dans les frottis peut être utilisée pour identifier le stade du cycle oestral de votre souris sur le jour du prélèvement de l'échantillon (figure 1D-G). Pendant proestrus, les cellules sont presque exclusivementdes grappes de ronde, bien formée nucléées cellules épithéliales (figure 1D, cellule représentant a indiqué par la flèche blanche). Au cours de l'oestrus, les cellules sont principalement cornified cellules épithéliales squameuses, présents dans les amas denses (figure 1E, cellule représentant a indiqué par flèche). Pendant metestrus, petits leucocytes colorés en foncé prédominent (figure 1F, cellule représentant a indiqué par la flèche noire). Cornified cellules épithéliales squameuses peuvent être observés, souvent en fragments, (figure 1F, cellule représentant a indiqué par flèche noire). Pendant diestrus, rares cornées cellules épithéliales squameuses peuvent encore être présentes (figure 1G, cellule représentant a indiqué par flèche noire), mais les leucocytes continuent de prédominer (figure 1G, cellule représentant a indiqué par la flèche noire). Metestrus peut être distingué de dioestrus par l'apparition de cellules épithéliales nucléées dans dioestrus ( <stron g> Figure 1G, cellule représentant a indiqué par la flèche blanche). Figure 1. L'évaluation cytologique des frottis vaginaux peuvent être utilisés pour identifier stade oestrus Trois principaux types cellulaires sont détectées dans des échantillons de frottis vaginaux:. (A) nucléées, les cellules épithéliales (B) cornées squameuses cellules épithéliales, et (C) des leucocytes. Le rapport de ces types de cellules présents dans le frottis peut être utilisée pour identifier les souris (D) proestrus, (E) l'oestrus, (F) metestrus, ou (G) tel que décrit dans dioestrus résultats représentatifs. Têtes de flèches noires en E, F et G à représentatives point de cornées cellules épithéliales squameuses. Les flèches noires en C, F et du point G à leykocytes représentatives. Les flèches blanches dans D et G représentant culminant nucléation des cellules épithéliales. . Jpg "alt =" Figure 2 "/> Figure 2. Cytologie sur frottis vaginal reflète les événements endocriniens sous-jacents. Détails sont également fournis dans le rapport. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 3. Cristaux d'acide urique peuvent être présentes ci-dessous coloration au cristal violet d'urine contaminés par des échantillons. (A) Les cristaux sont transparents et peuvent être de tailles différentes (flèches et de la région en boîte agrandies en (B)). Pas de cellules sont présentes dans ce domaine. Devrait urique contamination cristal d'acide dans les champs utilisés pour la coloration cytologique être présent, il peut être difficile d'identifier avec précision les types cellulaires présents et le frottis doit être jeté. Barres d'échelle = 50 um.