Produzione e utilizzo di Piggy-back Multibarrel Elettrodi per<em> In vivo</em> Manipolazioni farmacologiche di risposte neurali

Tirare elettrodi di vetro Tirare elettrodi di vetro Tirare singolo elettrodo barile. Usa vetro singolo barile capillare con filamento e tirare punta ad un diametro di circa 1-2 micrometri, lunghezza albero di 10-12 mm, e la resistenza corrispondente elettrodo di circa 12 MOhm (range 5-20 MOhm), misurato in 0,9% di soluzione di NaCl. Resistenze elettrodo inferiore si tradurrebbe in attività di fondo più e quindi più difficoltà ad isolare l'attività unitaria di singoli neuroni. Per tirare questo elettrodo, utilizzare un estrattore orizzontale o verticale, sia con filamenti di riscaldamento o serpentine di riscaldamento. Tirare elettrodo multibarrel. Causa del diametro molto più grande di vetro multibarrel e la necessità di una distribuzione uniforme del calore attorno al multibarrel intero, un estrattore potente con una bobina di diametro maggiore riscaldamento, non un filamento di riscaldamento, è necessario. Una pipetta multibarrel deve essere inserito nel centro del filamento riscaldante con no contattare per la batteria di riscaldamento. Si noti che oltre alle 5 canna pipette qui descritto, a 3 o 7-barile barile pipette sono alternative disponibili in commercio. Tirare vetro per un puntale di circa 10 micrometri di diametro totale, o meno. La punta sarà rotto al giusto diametro nel passaggio successivo, quindi la dimensione esatta punta è meno critico durante il processo d'estrazione che la forma complessiva della punta dell'elettrodo, che dovrebbe essere lunga e relativamente sottile. Vedere l'immagine in figura 1C per la forma desiderata punta dell'elettrodo. Forme elettrodo corto e tozzo (Figura 1B) causerà una notevole quantità di danno tissutale quando avanzare nel cervello, mentre le forme di elettrodi molto lunghi e sottili (Figura 1A) si piega e quindi renderà difficile rompere la punta dell'elettrodo per la corretta diametro (vedi punto 2). Modifica punte degli elettrodi Modifica punte degli elettrodi. Prima che i due elettrodi possono essere incollati, Devono essere modificati. L'albero del singolo elettrodo deve essere piegata prima di essere attaccato al multibarrel per assicurarsi che l'albero combinato del finito piggy-back elettrodo è il più sottile possibile. Inoltre, la punta dell'elettrodo multibarrel deve essere interrotto per garantire bassa resistenza per ionoforesi. Piegare albero di un elettrodo canna singola di circa 20 gradi. Utilizzare più piccolo possibile, la fiamma del bruciatore Bunsen. Tipici "piccoli" becchi Bunsen da società di fornitura standard di laboratorio creano dei formati di fiamma che sono di gran lunga troppo grande per questa applicazione. Per aggirare questo problema utilizzare il più piccolo bruciatore commerciale Bunsen e fissare un ago di siringa (~ 18 gauge) alla parte superiore del bruciatore, e sigillare la connessione con cemento dentale. Se utilizzato, la fiamma dovrebbe essere difficile da vedere, circa 5 mm o meno di diametro, e circa 8 mm di altezza. Qualsiasi movimento dell'aria nel locale si spegne la fiamma, quindi è una buona idea per azionare il bruciatore in unambiente chiuso, o di utilizzare scudi vento. Spostare l'elettrodo singolo canna attraverso la fiamma piegare di circa 20 gradi. Mirano ad avere la fiamma del bruciatore fondere il vetro nella zona di transizione a circa 10 millimetri di distanza dalla punta dell'elettrodo. Per evitare di fondere la punta dell'elettrodo suggeriamo che l'elettrodo si terrà a circa 45 gradi, punta rivolta verso il basso, e spostare l'elettrodo attraverso la fiamma in modo relativamente rapido. Rompere la punta dell'elettrodo multibarrel. Per garantire un controllo visivo, mentre rompere la punta dell'elettrodo, utilizzare un microscopio con un obiettivo minimo di 10x e oculari 10x. Una scala di misura inserito nel oculare saranno necessarie anche per misurare dimensioni di ugello. Attaccare un pezzo di plexiglass al microscopio tale che l'estremità del plexiglass può essere visto in circa un terzo a metà del campo di vista del microscopio. Nel nostro caso, il pezzo plexiglass è di circa 25 x 70 mm e spessore 5 mm e collegato tramite una vite che può essere fissato in un personalizzatoresi thread nella fase microscopio. È importante avere un design che permette l'plexiglass movimento indipendente della slitta. Posizionare l'elettrodo multibarrel in un letto di argilla da modellare su un vetrino, e inserire la diapositiva contenente l'elettrodo nel supporto diapositive palco microscopio. Utilizzando manipolatori xy la fase microscopio, spostare delicatamente la punta dell'elettrodo contro il pezzo in plexiglass, e osservare la rottura della punta attraverso gli oculari del microscopio. Tentativo di rompere in modo pulito la punta del multibarrel per un diametro complessivo di circa 25-35 micrometri. Scartare pipette con diametro punta che si è staccato troppo grande, o punte con interruzioni irregolari. Noi eliminare circa il 30% dei nostri elettrodi multibarrel a causa di forme punta indesiderati. Montare Piggy-back Elettrodo Montare piggy-back elettrodo. Elettrodi di posizione. Togliere il cilindro di plexiglass utilizzato nel passaggio 2.2 dal palco microscopio. Fissare completatomultibarrel elettrodo nella plastilina su un vetrino, punta rivolta leggermente verso l'alto. Rivolta verso l'alto sarà importante per passo 3,2, l'incollaggio dei due elettrodi. Suggerimenti che puntano a causare la colla di fuggire dalla punta, evitando incollaggio delle punte degli elettrodi. Inserire elettrodo canna singola piegato in porta elettrodo del micromanipolatore misura (Figura 2). Utilizzo di guida visiva e poi la guida microscopica, abbassare l'elettrodo singolo barile sull'elettrodo multibarrel. Il singolo elettrodo deve essere abbassata direttamente nella scanalatura che è formata dalla disposizione delle canne 5, con la punta sporgente della punta della punta multibarrel di circa 5-10 micrometri. Quando si abbassa la canna singola, osservare attentamente l'angolo che si forma tra i due elettrodi. Per i migliori risultati evitare angoli in cui le punte puntano l'uno dall'altro, ma piuttosto il tentativo di abbassare il singolo elettrodo sulla multiplo perfettamente parallelo o anche con la sua puntatoccare il multibarrel primo formando disposizione un 'cuneo' MOLTO leggera. Poiché la punta canna singola è molto flessibile, si piega quando il singolo elettrodo si abbassa un po 'più dopo che la punta ha raggiunto la superficie superiore dell'elettrodo canna multi, formando una punta pulita composito che ha una piccola quantità di molla costruita in che aiuta a tenere le punte insieme. Tuttavia, se l'angolo tra canna singola e multibarrel elettrodo è troppo ripido (troppo di un cuneo), l'azione della molla sarà troppo alto e piegare verso il basso elettrodi disposizione. Alberi elettrodi Colla insieme. Incollare gli alberi dei due elettrodi insieme con cianoacrilato (colla). Mettere una goccia di colla sul lato piccolo di uno stuzzicadenti piatto e elettrodo assemblaggio contatto con la goccia di colla. Iniziare dalla posizione più distale delle punte e spostare lentamente stuzzicadenti con una caduta di colla lungo alberi elettrodi verso le punte degli elettrodi. Usando la colla troppo, o l'applicazione di colla too vicino alle punte degli elettrodi comporta incollaggio aperture elettrodi, rendendo l'elettrodo almeno parzialmente non funzionale. Stabilizzare congiunta con il cemento dentale. Miscelare una piccola quantità di cemento dentale e acrilico dentale in un piccolo piatto di plastica usa e getta o di peso in barca, con uno stuzzicadenti piatto. Attendere fino cemento diventa modellabile e applicare una piccola quantità al giunto tra i due elettrodi per stabilizzare l'articolazione (materiale rosa in Figura 3). Attendere circa 15 minuti ad asciugare. Rimuovere e conservare elettrodo. Rimuovere con cautela il termine piggy-back primo elettrodo dal supporto micromanipolatore, e quindi staccare dal vetrino, e conservare in un contenitore a prova di polvere. Preparare le soluzioni di riempimento elettrodi Preparare soluzioni di riempimento dell'elettrodo. Poiché ionoforesi richiede molecole cariche, la maggior parte agenti devono essere disciolto o in un ambiente acido o alcalino (tipicamente unta di circa pH 3-4, o un pH di circa 8-10, rispettivamente). Un certo numero di sostanze chimiche che vengono spesso utilizzati in ionoforesi sono elencati nella Tabella 1. Per gli agenti che non sono elencati nella tabella, determinare dal valore pKa, se sia più facile da usare la molecola in un acido o un ambiente alcalino per mantenere la molecola carica, e sciogliere conseguenza. Per ottenere i migliori risultati, mescolare tutte le soluzioni fresco tutti i giorni. Riempire e preparazione Elettrodi Riempire e preparare elettrodi. Appena prima di usare l'elettrodo, back-riempire ogni botte con la sua rispettiva droga, utilizzando fibra di carbonio 28-34 aghi attaccato ad siringhe con filtri per siringa. Riempire le 4 canne esterne del 5 canna configurazione con i farmaci di scelta, e il barile centro con 3M NaCl come un barile di bilanciamento. Riempire il singolo elettrodo di registrazione botte con 3M NaCl pure. Aggiunta di un colorante per la soluzione di NaCl, come veloce verde o rosso fenolo renderà più facile vedere la punta dell'elettrododurante il posizionamento degli elettrodi sulla superficie del cervello. Inserire l'elettrodo nel portaelettrodo della configurazione della registrazione e inserire tutti i fili nelle botti di vetro appropriati. Utilizzare isolato filo d'argento, da cui circa 1 cm di isolamento è stato rimosso alla punta. Ci dovrebbero essere 5 fili per l'elettrodo multibarrel (4 barili droga e un barile di bilanciamento), più il filo amplificatore che deve essere inserito nel singolo elettrodo canna registrazione. Attivare moduli pompa Ionoforesi Attivare moduli pompa ionoforesi e testare tutti i barili. La funzione di test elettrodo di ciascun modulo pompa sarà possibile stabilire se la canna elettrodo è funzionale. Per evitare perdite dei farmaci dalle canne quando non in uso, una tensione di ritenzione nella polarità opposta alla carica molecola deve essere applicato.