Determinazione delle acidità in fase gassosa di oligopeptidi

Le acidità di residui di aminoacidi sono tra i più importanti proprietà termochimici che influenzano le strutture, la reattività, e dei processi di piegatura-unfolding di proteine ^​​9,19. Residui di singoli aminoacidi mostrano spesso diverse acidità efficaci a seconda delle loro posizioni in proteine. In particolare, i residui presenti in altri siti attivi presentano spesso perturbato significativamente acidità. Un esempio è il residuo di cisteina che risiedono nei siti attivi della tioredossina super-famiglia di enzimi ^20,21. Il sito attivo è insolitamente cisteina acido rispetto a quelle in dispiegato proteine ^​​3-5. È stato suggerito che la conformazione elicoidale può avere un contributo significativo alla acidità insolito. Ci sono ampi studi sperimentali sulle proprietà acido-base di peptidi effettuati in soluzioni, specialmente in soluzioni acquose ^2,6-8. I risultati sono stati spesso complicati da effetti solvente^7. Infatti, la maggior parte dei siti attivi di proteine ​​si trovano vicino alla regione interna dove effetti del solvente sono minimizzati ^9,10.

Per comprendere intrinseche proprietà acido-base di peptidi e proteine, è importante realizzare gli studi in un ambiente privo di solventi. Qui si introduce un metodo di spettrometria di massa a base per la determinazione dell'acidità in fase gas. L'approccio è indicato come il metodo cinetico Cuochi esteso. Questo metodo è stato applicato con successo per una vasta gamma di sistemi chimici per la determinazione delle varie proprietà termochimici, come l'acidità in fase gassosa, l'affinità protonica, lo ione metallico affinità, l'affinità elettronica, e l'energia di ionizzazione ^{11-15, 22-26.} Abbiamo applicato questo metodo per determinare le acidità in fase gas di una serie di oligo-cisteina-cisteina e polialanine polyglycine peptidi ^17,18,27. Questi studi dimostrano che la cisteina N-terminale peptidees sono significativamente più acido di quello dei corrispondenti quelli C-terminale. Le alte acidità delle prime sono probabilmente dovuti agli effetti conformazionali elicoidali in cui l'anione tiolato è fortemente stabilizzato dalla interazione con l'elica macro-dipolo. A causa della natura non volatile e termicamente labile di peptidi, il metodo cinetico è l'approccio più pratico attualmente disponibili per produrre ragionevolmente accurate acido-base termochimici quantità di peptidi ^28.

Nel regime generale e l'equazione associato al metodo cinetico sono mostrati in Figura 1. La determinazione dell'acidità in fase gassosa di un peptide (AH) inizia con la formazione di una serie di cluster di anioni protone-bound, [A • H • A _i] ¯ (o [A ⁺ H ¯ • • A _i ¯] ¯), nella regione di sorgente ionica dello spettrometro di massa, dove A e A _i ¯ ¯ sono le forme deprotonate del peptide egli acidi di riferimento, rispettivamente. Gli acidi di riferimento sono composti organici con noti acidità in fase gas. Gli acidi riferimento dovrebbero avere strutture analoghe tra loro (ma non necessariamente simile a quella del peptide). La somiglianza delle strutture tra acidi riferimento assicura la somiglianza dei entropie di deprotonazione tra loro. Il cluster protone-bound anioni vengono selezionati e massa collisionally attivati ​​e successivamente dissociato usando dissociazione (CID) esperimenti di collisione indotti a cedere gli anioni corrispondenti monomeriche, A e A _i ¯ ¯, con rate costanti di K e K _i, rispettivamente, mostrata in Figura 1a. Se frammentazioni secondarie sono trascurabili, il rapporto di abbondanza dei frammenti ionici CID, [A ¯] / [A _i ¯], rappresenta una misura approssimativa del rapporto tra le costanti di velocità, k / k _i. Partendo dal presupposto che non ci sono attivata inverso, [A °] / [A _I °], verrà linearmente correlati all'acidità fase gas del peptide (Δ _acido H) e quelli degli acidi riferimento ln barriere per entrambi i canali ionici dissociazione, il CID ione prodotto branching ratio _(acido Δ H _i), come mostrato in Figura 1b. In questa equazione, _acido Δ H _avg è la media acidità in fase gassosa degli acidi riferimento, Δ (Δ S) è il termine entropia (che può essere assunta costante se gli acidi riferimento sono strutturalmente simili tra loro), R è la costante universale dei gas, e T _eff è la temperatura effettiva del sistema. La temperatura efficace è un parametro empirico che dipende da diverse variabili sperimentali, inclusi l'energia di collisione.

Il valore di acidità in fase gassosa è determinato disegnando due serie di trame termo-cinetici. La prima serie è obcontenute tracciando ln ([A ¯] / [A _i ¯]) contro _l'acido Δ H _i – _acido Δ H _avg, come mostrato nella figura 4a. La regressione lineare produrrà una serie di linee rette con le piste di X = 1 / RT _eff e intercetta di Y = – [Δ H _acido – _acido Δ H _avg] / RT _eff – Δ (Δ S) / R. La seconda serie di trame viene ottenuta riportando le intercettazioni risultanti (Y) con la prima serie contro le corrispondenti piste (X), come mostrato in Figura 4b. La regressione lineare produce una nuova linea con una pendenza di Δ H _acido – _acido Δ H _avg e un'intercettazione di Δ (Δ S) / R. Il valore di Δ _acido H si ottiene poi dal pendio e il termine entropia, Δ (Δ S), è ottenuto dal'intercetta.

Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo interfacciato ad un ionizzazione elettrospray (ESI) sorgente di ioni. Un diagramma schematico dello spettrometro di massa è mostrato in Figura 2. Gli esperimenti vengono eseguiti CID in massa selezionando gli anioni del cluster protone-bound con la prima unità quadrupolo e permettendo loro di sottoporsi collisioni con atomi di argon fuoriusciti nella camera di collisione mantenuto ad una pressione di circa 0,5 mTorr. Gli ioni prodotti di dissociazione di massa sono analizzati con la terza unità quadrupolo. Gli spettri CID sono registrati in diverse energie di collisione con il range m / z sufficientemente ampia da coprire tutte le possibili frammenti secondari. I CID intensità di ioni prodotti vengono misurate impostando lo strumento nel monitoraggio reazione selezionato (SRM) modalità in cui la scansione è focalizzata sulla ioni prodotti selezionati. Gli esperimenti CID vengono eseguite in quattro diverse energie di collisione, che corrispondono aenergie centro-di-massa (E _cm) di 1.0, 1.5, 2.0, e 2.5 eV, rispettivamente. L'energia centro-di-massa è calcolata usando l'equazione: E = E _{cm lab} [m / (M + m)], dove E è l'energia _laboratorio collisione nel sistema del laboratorio, m è la massa di argon, e M è la massa dello ione cluster di protone-bound.

In questo articolo, si usa il oligopeptide Ala ₃ CysNH ₂ (A ₃ CH) come composto modello. Il C-terminale è amidate e il gruppo tiolo (SH) del residuo cisteina sarà il sito acida. La selezione degli acidi riferimento adeguati è fondamentale per la misurazione riuscita dell'acidità fase gas. Gli acidi riferimento ideali sono strutturalmente simili (tra loro) composti organici con valori di acidità in fase gas ben consolidati. Gli acidi di riferimento devono avere valori di acidità prossime a quella dei peptidi. Per il peptide A ₃ CH, sei alogenati carboxyliacidi c sono scelti come gli acidi di riferimento. Gli acidi di riferimento sei sono cloroacetico (MCAH), acido bromoacetico (Mbah), acido difluoroacetic (DFAH), acido dicloroacetico (DCAH), acido dibromoacetic (dban), e trifluoroacetico (TFAH). Due di loro, DFAH e Mbah, saranno utilizzati per illustrare il protocollo.