Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato
Summary
Recentemente técnicas de imagem desenvolvidos utilizando fluorescência no infravermelho próximo (NIRF) pode ajudar a elucidar a função do sistema linfático desempenha na metástase do cancro, a resposta imune, reparação de feridas, e outras doenças associadas linfático.
Abstract
O sistema vascular linfático é um componente importante do sistema circulatório, que mantém a homeostase de fluidos, proporciona vigilância imune, e medeia a absorção de gordura no intestino. No entanto, apesar de sua função crítica, há relativamente pouco entendimento de como o sistema linfático se adapta para servir estas funções na saúde e na doença 1. Recentemente, demonstramos a capacidade de arquitetura dinamicamente imagem linfática e linfa "bombear" ação em indivíduos normais, bem como em pessoas que sofrem de disfunção linfática usando a administração traço de um infravermelho próximo fluorescente corante (NIRF) e um costume, Gen III- intensificou imagens do sistema 2-4. NIRF imagem mostrou mudanças dramáticas na arquitetura linfática e função com a doença humana. Ainda não está claro como essas mudanças ocorrem e novos modelos animais estão sendo desenvolvidas para elucidar a sua base genética e molecular. Neste protocolo, apresentamos NIRF linfático, sMall animais imagiologia 5,6 utilizando verde de indocianina (ICG), um corante que tem sido utilizado há 50 anos em humanos 7, e um corante NIRF marcado albumina domínio de ligação cíclica (CABD-IRDye800) péptido que se liga preferencialmente de rato e humano 8 albumina . Aproximadamente 5,5 vezes mais brilhante do que ICG, Abd-IRDye800 tem um perfil semelhante linfático e depuração pode ser injectada em doses menores do que os sinais de ICG para realizar NIRF suficientes para imagiologia 8. Porque se ligam CABD-IRDye800 ICG e de albumina no espaço intersticial 8, que tanto pode representar o transporte de proteínas activas para dentro e para dentro dos vasos linfáticos. Intradérmica (ID) injecções (ul 5-50) de ICG (645 uM) ou CABD-IRDye800 (200 fiM) em solução salina são administrados para o aspecto dorsal de cada pata traseira e / ou no lado esquerdo e direito da base do cauda de um rato anestesiado com isoflurano-. A concentração do corante, resultando em que o animal é 83-1,250 ug / kg para o ICG ou 113-1,700 mg / kg paraAbd-IRDye800. Imediatamente após as injeções, imagem funcional linfática é realizada por até 1 hora usando um personalizado, pequenos animais NIRF sistema de imagem. Resolução espacial animal inteiro pode descrever vasos linfáticos fluorescentes de 100 microns ou menos, e as imagens de estruturas até 3 cm de profundidade podem ser adquiridos 9. As imagens são adquiridas usando V + software + e analisados usando ImageJ ou software MATLAB. Durante a análise, as regiões consecutivos de interesse (ROIs) abrangendo o diâmetro do vaso inteiro são atraídos ao longo de um vaso linfático dado. As dimensões de cada ROI são mantidas constantes para um dado navio e intensidade NIRF é medido para cada ROI para avaliar quantitativamente "pacotes" de linfa em movimento através dos vasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós usamos um costume, de pequenos animais NIRF sistema de imagem para capturar imagens de vasos linfáticos marcados em camundongos. Para construir filmes do movimento da linfa, 300 ou mais imagens são coletadas. Para a análise funcional do sistema linfático de filmes, ROIs dois ou mais são manualmente desenhadas ao longo de um vaso linfático. As dimensões da ROIs são mantidas constantes para cada navio e são de aproximadamente o diâmetro do vaso. Enquanto a resolução espacial animal inteiro pode descrever …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado pelas seguintes subsídios para Eva Sevick: NIH R01 CA128919 e NIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
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