Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse
Summary
Tecniche di imaging di recente sviluppate utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) può aiutare a chiarire il ruolo del sistema linfatico gioca in metastasi del cancro, la risposta immunitaria, la riparazione delle ferite, e altre malattie associate linfatico.
Abstract
Il sistema vascolare linfatico è un componente importante del sistema circolatorio che mantiene l'omeostasi fluido, fornisce la sorveglianza immunitaria, e media l'assorbimento di grassi nell'intestino. Eppure, nonostante la sua funzione critica, non vi è la comprensione relativamente poco di come il sistema linfatico si adatta a servire queste funzioni in materia di salute e malattia 1. Recentemente, abbiamo dimostrato la capacità di architettura dinamica linfatica immagine e linfa azione "pompaggio" in soggetti umani normali e anche a persone che soffrono di disfunzione linfatica mediante somministrazione traccia di un vicino infrarosso fluorescente (NIRF) colorante e un costume, Gen III- intensificata sistema di imaging 2-4. NIRF di imaging hanno mostrato cambiamenti drammatici in architettura linfatica e la funzione con la malattia umana. Non è ancora chiaro come questi cambiamenti si verificano e di nuovi modelli animali che sono in fase di sviluppo per chiarire la loro base genetica e molecolare. In questo protocollo, presentiamo linfatico NIRF, small animale Imaging 5,6 utilizzando verde indocianina (ICG), un colorante che è stato usato per 50 anni nell'uomo 7, e un colorante marcato NIRF ciclico dominio di legame (CabD-IRDye800) peptide che si lega preferenzialmente topo e albumina umana 8 . Circa 5,5 volte più luminoso di ICG, 'Abd-IRDye800 ha un profilo simile gioco linfatico e può essere iniettato in piccole dosi di ICG per ottenere segnali NIRF sufficienti per l'imaging 8. Poiché sia bind 'Abd-IRDye800 e ICG all'albumina nello spazio interstiziale 8, entrambi possono descrivere trasporto attivo le proteine in e nei vasi linfatici. Intradermica (ID) iniezioni (microlitri 5-50) di ICG (645 uM) o CabD-IRDye800 (200 pM) in soluzione salina sono somministrati al dorso di ciascuna zampa posteriore e / o il lato sinistro e destro della base del coda di un topo anestetizzato-isoflurano. La concentrazione di colorante conseguente animale è 83-1,250 mcg / kg per ICG o 113-1,700 mg / kg per'Abd-IRDye800. Subito dopo le iniezioni, l'imaging funzionale linfatico è condotto per un massimo di 1 ora con un personalizzato, piccolo sistema animale NIRF imaging. Risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici fluorescenti di 100 micron o meno, e le immagini di strutture fino a 3 cm di profondità possono essere acquisite 9. Le immagini sono acquisite in V + software + e analizzati utilizzando il software ImageJ o MATLAB. Durante l'analisi, consecutivi regioni di interesse (ROI) comprende l'intero diametro nave sono disegnati lungo un vaso linfatico dato. Le dimensioni di ogni ROI sono mantenute costanti per un determinato peschereccio e intensità NIRF è misurato per ciascuna ROI per valutare quantitativamente "pacchetti" di linfa si muove attraverso le navi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usiamo una consuetudine, piccolo sistema animale NIRF immagini per catturare immagini di vasi linfatici etichettati nei topi. Per costruire film di circolazione linfatico, 300 o più immagini sono raccolte. Per l'analisi funzionale dei vasi linfatici da film, ROI due o più sono disegnata a mano lungo un vaso linfatico. Le dimensioni della ROI sono mantenute costanti per ciascun recipiente e sono approssimativamente il diametro del vaso. Mentre risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da i seguenti aiuti a Eva Sevick: NIH R01 CA128919 e NIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
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