Allevamento e iniezione di<em> Manduca sexta</em> Le larve per valutare virulenza batterica
Summary
Il metodo qui descritto utilizza l'iniezione diretta di batteri entomopatogeni nella hemocoel di<em> Manduca sexta</em> Larve di insetti.<em> M. Sexta</em> È un insetto disponibile in commercio e ben studiata. Quindi, questo metodo rappresenta un approccio semplice per analizzare interazioni host-batteriche dalla prospettiva di uno o entrambi i partner.
Abstract
Manduca sexta, comunemente noto come il hornworm tabacco, è considerato un parassita agricolo significativo, nutrendosi di piante solanacee tra cui tabacco e pomodoro. La suscettibilità di M. larve sexta ad una varietà di specie di batteri entomopatogeni 1-5, così come la ricchezza di informazioni disponibili riguardo al sistema immunitario dell'insetto 6-8, e la sequenza del genoma in attesa di 9 ne fanno un organismo buon modello per l'uso in studio delle interazioni ospite-microbo durante la patogenesi. Inoltre, M. larve sexta sono relativamente grandi e facili da manipolare e mantenere nel relativo laboratorio per altre specie sensibili insetti. Loro grandi dimensioni facilita anche efficiente tessuto / emolinfa estrazione per analisi della risposta dell'ospite all'infezione.
Il metodo qui presentato descrive l'iniezione diretta di batteri nella hemocoel (cavità sangue) di M. Sexta larve. Questo approcciopuò essere utilizzato per analizzare e confrontare le caratteristiche di virulenza di varie specie batteriche, ceppi mutanti, o semplicemente controllare il tempo di morte insetto dopo l'iniezione. Questo metodo è stato sviluppato per studiare la patogenicità di Xenorhabdus e specie Photorhabdus che associano di norma con i vettori di nematodi come mezzo per entrare in l'insetto. Nematodi entomopatogeni in genere infettano le larve tramite digestivo naturale o aperture respiratorie, e di rilasciare il loro contenuto simbiotici batteriche nella emolinfa insetto (sangue) poco dopo 10. Il metodo descritto qui di iniezione evita il bisogno di un vettore nematode, quindi sganciare gli effetti dei batteri e nematodi sul insetto. Questo metodo permette di conteggio accurato del materiale infetto (cellule o proteine) entro l'inoculo, che non è possibile utilizzare altri metodi esistenti per analizzare entomopathogenesis, compresi nick 11 e saggi di tossicità orale 12 <em>. Inoltre, test di tossicità orale affrontare la virulenza di tossine secrete introdotte nel sistema digerente delle larve, mentre il metodo di iniezione diretta affronta la virulenza di cellule intere inoculi.
L'utilità del metodo di iniezione diretta, come descritto qui è analizzare patogenesi batterica monitorando mortalità insetto. Tuttavia, questo metodo può essere facilmente espanso per uso a studiare gli effetti di infezione sul M. sexta sistema immunitario. L'insetto risponde alle infezioni tramite sia le risposte umorali e cellulari. La risposta umorale comprende il riconoscimento di batteri associati modelli e conseguente produzione di vari peptidi antimicrobici 7, l'espressione di geni che codificano questi peptidi possono essere monitorati dopo infezione diretta tramite estrazione di RNA e PCR quantitativa 13. La risposta cellulare di infezione coinvolge nodulazione, incapsulamento, e fagocitosi di agenti infettivi attraverso emociti 6 </sup>. Per analizzare queste risposte, insetti iniettato può essere sezionato e visualizzati mediante microscopia 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'iniezione diretta di M. larve sexta con batteri entomopatogeni, come descritto qui, serve come un mezzo semplice ed efficace per analizzare la virulenza batterica. Il metodo è anche forte adattabilità a diversi soggetti sperimentali e / o condizioni. I batteri possono essere preparati in diversi modi prima dell'iniezione. Nel caso di X. nematophila, le cellule coltivate in di tipo selvatico ricco di sostanze nutritive Luria-Bertani (LB) medio a metà-log fase sono in genere i più …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri passati del Goodrich Blair-lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, e Youngjin Parco per il loro contributo allo sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation concessione IOS-0950873 e il National Institutes of Health NRSA comunione FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
Referenzen
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
