Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

1. Preparación de platos ECM Cultura recubiertos o Cubreobjetos Preparar la solución ECM de stock de disolución de sustrato ECM en PBS (Dulbecco-buffer fosfato salino, Invitrogen, # 14040-133). Filtrar con un filtro de jeringa de 0,2 mm (VWR, # 28145-495) y congelar en alícuotas a -80 ° C. Diluir solución ECM en PBS a la concentración deseada. Para MaxGel, diluir en DMEM (Dulbecco modificada de Eagle medio, Invitrogen, # 11995-065). Si inmunofluorescencia se realizará, esterilizar 12 mm cubreobjetos circulares de vidrio (VWR, # 89015-724) mediante inmersión en etanol y dejar secar al aire. Esto debe hacerse en la campana laminar estéril. Si inmunofluorescencia no se llevará a cabo el paso 1.5. Lugar esterilizado cubreobjetos en cada pocillo de una placa de pocillos 24 (Corning, n º 3526). Añadir 0,5 ml de solución de substrato diluido a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incuba a temperatura ambiente durante 3 h. Aspirar la solución de ECM y lavar three veces en PBS. Aspirar fuera de PBS y utilizar inmediatamente o envueltos en parafilm y se almacenaron a 4 ° C durante hasta 2 semanas. 2. Preparación de herramientas de disección Placas de Sylgard con carbón vegetal añadido se preparan según el protocolo del fabricante. El fondo negro resistente de estas placas proporciona soporte para la fijación abajo el embrión y el color ofrece un buen contraste que facilita la visualización del embrión translúcido. Para preparar las placas pesan directamente en un vaso de precipitados de tri-vierta en una balanza de 150 g de pieza en forma líquida 15 g Parte B y 1 g de polvo de carbón vegetal (World Precision Instruments, # SYLG184). Mezclar con un palito de madera o un depresor de lengua. Verter en vaso de plástico o placas de 100 cm. Utilice un soplete de butano pequeño lugar de 10 a 12 pulgadas por encima de los platos para quemar eventuales burbujas. Coloque las tapas en las placas y dejar reposar durante al menos 24 horas para ajustar. Para preparar las herramientas de disección inserte un alfiler Minutien (0,1 mm diameter) en un soporte de pasador (Fine herramientas científicas, # 26002-10 y # 26018-17, respectivamente) como alternativa agujas de calibre 26 (BD, # 309597) dobladas en ángulo recto con la ayuda de fórceps puede utilizarse como instrumentos de disección. Afilado estudiantes Dumont # 5 Pinzas (Herramientas Artes Ciencia, # 91150-20) con una piedra de afilar (Fine Herramientas Científicas, # 29008-22). Esterilizar todas las herramientas de disección con 70% de etanol antes de su uso. 3. Colección de Embriones Sacrificar al ratón cronometrado embarazada en 8,5 días post coito acuerdo con la normativa de animales Comité de Uso y extraer el útero. Place útero en una placa Petri de plástico con PBS estéril. Lavar útero una vez con PBS estéril. Bajo un microscopio de disección cuidadosamente quitar embrión de deciduas utilizando un par de pinzas. Retire las membranas extraembryonic y ahorrar para el genotipado de ser necesario. Etapa embrión contando somites. Las etapas ideales para hacer explantes para analizar celular behAvior durante la elevación del pliegue neural estaría entre los 6 y 10 somite etapas cuando los pliegues neurales están comenzando a elevar y antes de la morfogénesis importante del mesénquima craneal lleva a cabo. Lavar embrión en PBS. Colocar en un plato negro sylgard con DMEM que no contiene rojo fenol (Invitrogen, # 21,063-029). Retire las membranas extraembryonic y ahorrar para el genotipado de ser necesario. 4. Preparación de explantes Reorientar el microscopio en la magnificación más alta posible sobre la región de la cabeza del embrión. Haga cortes con una aguja de disección en cada mano. Use una aguja para mantener el tejido en su lugar y el otro para hacer los cortes. Cortar la cabeza del embrión anterior a los rhombomeres. Corte a lo largo de la línea media para dividir en dos la cabeza en dos mitades iguales. Corte alrededor de la periferia de la cabeza y la línea media. Estos recortes se eliminará la cresta premigratorias y ectodermo superficial en el borde exterior yla placa prechordal en la línea media. El tejido restante será el explante y contendrá la migración de la cresta neural craneal, mesodermo paraxial y ectodermo superficial. A medida que el tejido se corta, eliminar los restos disecados de la cápsula, utilizando una pipeta Pasteur estéril. Esto evita confundir el explante con los restos disecados. Lave suavemente el explante pipeteando arriba y abajo con una punta de pipeta y 20 l Pipetman. Esto eliminará las células débilmente conectados y evitar los bordes dentados en los explantes. Recoja cuidadosamente cada explante en aproximadamente 10 l de líquido utilizando una punta de pipeta y 20 l Pipetman y el lugar en el centro de la cultura pozo cubierto. Añadir 20 l de medio de cultivo suplementado con FBS al 15% para cubrir el explante. Colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado (5% de CO 2, 37 ° C) durante 1-2 horas para permitir que el explante para insertarse en el fondo del plato. Ver periódicamente para asegurar que el explante no se sequefuera. Cuando el explante se ha unido, añadir con cuidado a cada pocillo 250 l de DMEM suplementado con FBS al 10% que ha sido calentado a 37 ° C en un baño de agua. Una vez que haya adjuntado explantes que no se muevan cuando la placa se agita suavemente bajo el microscopio. Volver plato de cultivo de tejidos incubadora. Después de 24 horas, los explantes se estarán sólidamente sujetos y las células comienzan a emigrar. En este momento los agentes farmacológicos se pueden añadir a los medios de comunicación. 48 h después de la siembra, las células han emigrado de los explantes. La distancia migrada puede ser visualizado y formado la imagen. Por lo general detener la cultura en este punto ya explantes comienzan a mostrar signos de disminución de la viabilidad a largo incubaciones. Un colorante vital tal como naranja de acridina o azul de tripano también se puede utilizar para comprobar la viabilidad de los explantes. En este punto, las imágenes pueden ser adquiridas para documentar la distancia y el número de células que migran desde el explante. Alternativamente, si explantes se sembraron en cubreobjetos,que puede ser fijo y los análisis inmunohistoquímicos realiza para visualizar las proteínas de interés. Los pasos críticos en el protocolo Cortar explantes de aproximadamente el mismo tamaño. Borrar todos los residuos disección de la placa de disección como está disección para evitar escombros confuso con el tejido deseado explantado. Cuando explantes enchapado en pozos o en cubreobjetos asegúrese de colocar las gotas de los medios de comunicación con explante en el centro del pozo. Permitir explantar tiempo suficiente para fijar antes de inundar el bien con los medios de comunicación. Condiciones de tratamiento deben ser estandarizados para cada sustrato de ensayo y el agente farmacológico utilizado. Dos explantes se pueden hacer de cada embrión (uno de la izquierda y uno de la derecha del tubo neural). Cuando evaluar la migración de células de líneas de ratones mutantes en diferentes condiciones experimentales, poner un explante mutante en el grupo de control y el otro en el grupo tratado. Solución de problemas Si explantes no adjuntar, aumentar el tiempo asignado para su fijación. En nuestra experiencia, aproximadamente la mitad de los explantes no dan grandes explantes y se adhieren de manera más eficiente. Si explantes se adhieren a la periferia del bien que va a ser difícil de imagen. Asegúrese de colocar los explantes en el centro del pozo. Idealmente explantes será de aproximadamente el mismo tamaño. Sin embargo, las diferencias en tamaño del explante se puede corregir para usar el diámetro de los explantes como un factor de corrección cuando quanitating migraciones de células de explantes. Si se produce contaminación estar seguro estériles condiciones de trabajo están siendo utilizados. Todas las herramientas y superficies de trabajo deben ser esterilizados con 70% de etanol. Pipetas y placas de Petri debe ser nuevo y estéril. Si explantes se están perdiendo durante la disección, periódicamente remueven escombros para evitar la pérdida de explante. El dominio de la disección es mucho tiempo y requiere práctica. Optimal de aumento, herramientas disección cortante y ayuda agujas.