Zellspezifische Analyse<em> Arabidopsis</em> Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

Ein. Protoplasten-Generation Ernte Blattmaterial und schneiden Sie in 1 mm breite Streifen (Abbildung 1) mit einer Rasierklinge. Für Proben, die mehr als ein einzelnes Blatt bis zu 15 Blätter leicht vor dem Schneiden gestapelt werden. Sofortüberweisung Blatt Streifen in einen 9 cm Runde Petrischale mit 20 ml Lösung A (400 mM Mannitol, 20 mM MES Hydrat, 20 mM KCl, 10 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 0,1% BSA und 2,5 mM β-Mercaptoethanol, pH 5,7) einschließlich protoplasting Enzymen (1,2% Cellulose R-10, 0,6% Cellulose und 0,4% RS Macerozym R-10) und RNase-Inhibitoren und transkriptionelle (1 × ProtectRNA und 10 ug / ml Actinomycin D); sanft trennen die blatt Streifen und Vakuum zu infiltrieren für 2 × 5 min. Ort Petrischale auf einem Orbitalschüttler auf 90 rpm bei Raumtemperatur und Protoplasten für 3-4 Std. Während der Inkubation werden die Streifen sollten Blatt voneinander getrennt werden, unter Verwendung von aSatz von flachen Pinzette, um halb Stundentakt. Legen Sie eine 70 um Zellsieb (Fisher Scientific) in einem 50 ml-Tube und schonend filtern protoplasting Lösung durch. Dies entfernt die blatt Streifen, die durch das Sieb zurückgehalten werden, während es den Protoplasten zu durchlaufen wird. Waschen Sie die Blätter Streifen mit 4 ml Lösung A und sanft Filter durch dasselbe Sieb. Übertragen Sie die Protoplasten in Rundbodengefäße und zentrifugieren Sie die Protoplasten Lösung bei 300 xg für 5 min zur Pelletierung der Protoplasten. Sanft absaugen so viel von der Überstand wie möglich, ohne die Protoplasten. Waschen Protoplasten mit 5 ml Lösung A und Zentrifuge bei 300 × g für 5 min. Überstand entfernen Resuspendieren der Protoplasten in einem geeigneten Volumen der Lösung A unter Verwendung einer Pasteur-Pipette oder eines abgeschnittenen Spitze P1000. 2. FACS von Blattprotoplasten </p> Unmittelbar vor Sortierung, resuspendieren Protoplasten unter Verwendung eines (nicht geschnitten) P1000 Spitze um Protoplasten Verklumpen zu vermeiden. Übertragen Protoplasten zu einer Sortiermaschine Röhre durch ein 50 um Filcon Filter (BD Biosciences) und verdünnter gegebenenfalls zur Vermeidung von Verstopfungen der Düse des Zellsorters. Die Protoplasten werden unter Verwendung eines sortierten Düse 100 um bei einem Druck von 20 psi (Hülle) und 21 bis 21,5 psi (Probe), einer Frequenz von 39,2 kHz und einer Ereignisrate von <4000 (diese einstellungen sind optimal auf einem bd influx zellsortierer (bd biosciences). optimierung andere zelle sortiermaschinen müssen anpassungen an diesen einstellungen). gfp-positive protoplasten werden anhand einer 488 nm argon-laser und plotten der ausgabe von dem 580 30bandpass-filter (orange) gegenüber 530 40 (grün).im hohen low bevölkerung, mit nicht-gfp niedrig bevölkerung tot > Abbildung 2. Die KC464, KC274 und TP382 Linien in dieser Studie verwendet. A) Transversalschnitt einer KC464 Blatt mit GFP-Expression in der adaxialen Epidermis. B) Die Protoplasten aus Blättern KC464 abgeleitet. C) Transversalschnitt einer KC274 Blatt mit GFP-Expression in dem Gefäßsystem. D) Die Protoplasten aus Blättern KC274 abgeleitet. E) TP382 Blatt mit GFP-Expression in den Schließzellen. F) Protoplasten aus Blättern TP382 abgeleitet. G) Beispiel der Anreicherung durch FACS von GFP exprimierenden Schließzellen im Komplex Hintergrund Blattzellen, zeigt GFP enthaltenden Protoplasten aus der hohen 530/low 580 Population von Protoplasten aus Blättern TP382 gewonnen wird. AF: Konfokalmikroskop Bilder; G: Fluoreszenzmikroskop Bild. Maßstabsbalken in Bilder 50 um. Abbildung 3. Typische FACS-Dot-Plots Übernahme des Ausgangssignals aus den 580/30 nm (Orange) vs 530/40 nm (grün) Bandpassfiltern (BD Influx Zellsortierer). Die Sortier-Toren gezeigt, sind die in der Regel bei der Sortierung verwendet. A) Dot Grundstück von Col-4 Blatt abgeleitet Protoplasten, in Abwesenheit von Inhibitoren protoplasted, zeigt eine einzige niedrige 530/low 580 Bevölkerung. B) Dot-Plot von wt Col-4 Blatt-, Wurzel-Protoplasten in Gegenwart von Inhibitoren protoplasted, das eine Verschiebung in der 580-Fluoreszenz aufgrund von Stress und Färbung durch die Inhibitoren. CE) Dot Plots aus Blatt-, Wurzel Protoplasten aus den KC74, und KC464 TP382 Linien, die jeweils in Gegenwart von Inhibitoren protoplasted, zeigt den GFP enthaltenden Populationen im hohen 530/low 580 Populationen. Die Prozentsätze der Ereignisse in den GFP (high 530/low 580) Populationen gegeben sind. Klicken Sie hier, um größere Zahl anzuzeigen . e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Abbildung 4. GFP-Expression in den repräsentativen Population gated Fraktionen wie in Abbildung 3 dargestellt. Zwei biologischen repliziert wurden für jede Fraktion Typs erhalten wird, amplifiziert unter Verwendung der Ovation Pico WTA System und qPCR mit GFP-spezifische Primer (Tabelle 2) wurde dann durchgeführt. Die angegebenen Werte sind die höchsten (rot), am niedrigsten (grün) und die durchschnittliche relative Werte. Die hohe Population 580 war in diesem Fall zweigeteilt, niedrige und hohe 530/low 580 530/low 580, für die eine einzige biologische Replikation so verwendet wurde nur der einzelnen Wert dargestellt ist. ACT2 (At3g18780) wurde als Standard für alle Proben verwendet. Blatt: Whole Blatt. Unsorted: Unsorted Protoplasten. GFP1: hohe 530/low 580 und REST1: niedrig 530/low 580, GFP2: hohe 530/high 580 und REST2: niedrig 530/high 580, wie in Abbildung 3 und des Einsatzes beschrieben. Die Ergebnisse sind eine Verifikation of optische Beurteilung der GFP Zellinhalt in der sortierten Fraktionen (zB 2G). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . Probe Anzahl der Blätter Anzahl der Zellen RNA-Ausbeute (Ng) RNA-Ausbeute (Verstärkt; ng) Ganze Blatt A Ganze Blatt B 1 1 – – 8001 10525 4623 *** 4572 *** Unsorted Protoplasten A Unsorted Protoplasten B 5 5 – – 2433 2625 1152 *** 3321 *** GFP1 A REST1 A 15 6039 (0,39% *) 55389 (6.40% *) – ** – ** 861 489 GFP1 B REST1 B 15 10.783 (0,63% *) 57.040 (7,49% *) – ** – ** 537 420 GFP2 REST2 15 18.337 (1,49% *) 62.405 (73,49% *) – ** – ** 360 411 Tabelle 1. Proben gesammelt mittels FACS analysiert und mit qPCR zu bestimmen, welche Fraktion enthielt Live GFP-exprimierenden Protoplasten. Auch in dieser Tabelle nicht enthalten ist die gesamte RNA-Ausbeute in ng vor und nach der Verstärkung mit dem Ovation Pico WTA System (NuGen). GFP1, GFP2, REST1 und REST2 Fraktionen werden wie in dem Einsatz in 4 gezeigt. * Der Prozentsatz an Zellen der Gesamtzellzahl Sortierlauf wird in Klammern neben der Anzahl der Zellen in der Fraktion gegeben. Diese Prozentzahlen sind nicht zu korrelierendeneinander für jede Probe die FACS sortiert wird für 'Rest' Fraktionen wurden früher als GFP Fraktionen aufgrund der viel größeren Anzahl von Rest-Zellen gesammelt gestoppt. ** 50 ng als Input für Amplifikationsreaktionen verwendet, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Grundierung Folge mGFP5-ER.fw GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA mGFP5-ER.rv TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT ACT2.fw GCCATCCAAGCTGTTCTCTC ACT2.rv GCCATCCAAGCTGTTCTCTC Tabelle 2. QPCR Primer.