水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたEPAメソッド1623<em>クリプトスポリジウム</em>と<em>ジアルジア属。</em

1。タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過手順バッファーおよび溶液の調製： 溶出液（1 L）： 試薬グレード水1 Lは、0.1グラムのポリリン酸ナトリウム、0.1ミリリットルのTween-80、0.01ミリリットルY-30消泡剤を追加することができます。 生物学的安全キャビネット内でフィルタアセンブリ（ 図1）を準備します。 Masterflex I / P精密ブラシレスドライブに接続Masterflex I / Pイージーロードポンプヘッドを介してMasterflex I / P 73研究室チューブを挿入します。 ねじクランプ付きポンプヘッドの上流NPTブランチT-コネクタを装備0から60 PSI、グリセリン充填圧力計にチューブを固定し、ポンプヘッドのHDPE T-コネクタの下流に。 Masterflex L / S 15ラボチューブおよびT-コネクタとナルゲン53-B充填/ガス抜きキャップを装着し、1リットルのナルゲンヘビーデューティポリプロピレンボトルにそれを確保することにより残留液ボトルを組み立てる。 Masterflex L / S 24ワットチューブに適合i番目のピンチクランプ（ピンチクランプ2）HDPE T-コネクタに残留ボトルからそれを接続します。 圧力計から旭化成にMasterflex L / S 24ラボのチューブを接続するには、ネジクランプで25SハイフラックスダイアライザーをRexeedし、ダイアライザーから残留ボトルに。中空糸限外ろ過にチューブを接続するための¼ "IDチューブを収容するために設計されたカスタムメイドのDINアダプタを使用しています。 ピンチクランプ（ピンチクランプ1）でMasterflex L / S 24ラボのチューブに合わせて、サンプルの取り込みラインとして機能するように除去し、チップと綿プラグを10 mlのプラスチックピペットに接続し、HDPEにチューブを取り付け、T-コネクタに接続します。 ランプクランプMasterflex L/S-36ラボチューブの一方の端に合わせて、フィルタの出口端近くに排水ポートにチューブを接続します。廃棄物のコンテナ内のもう一方の端に置きます。 0.01％（w / v）の10リットルの水試料にポリリン酸ナトリウムと3分のミックスを追加します。 ピンチクランプ2を閉じます。と残留ボトルからベントキャップを取り外します。他のすべてのクランプが開いている必要があります。 圧力計（左、次の図1の右）にT-コネクタから流体を移動させるポンプの方向を設定します。最高速度の25％にポンプ速度を調整し、ポンプの電源をオンにします。 残留ボトルが2月3日、フルオープンピンチクランプ2であり、迅速に残留ボトルにベントキャップを交換するとき。漏れがないことを確認するために行と継手の全てをチェックしてください。 徐々に漏れがないかチェックし、希望のろ過率（約1.5 L /分）にポンプ速度を増加させます。メスシリンダーやタイマーや流量計を使用して、排水ライン（ 図1の青L / S 36チューブ）から出る水のろ過率を確認してください。気泡は、通常、それが困難な安定した圧力とろ過速度を達成するために行うフィルタの出口端部に形成することができます。これは、しばらく手で廃液ラインをつまんで修正されています。このアクション一般的にろ液ポートに気泡を同軸し、排水ラインを経由して終了します。エンドウ豆のサイズの気泡がしばしば不可避であることを念頭に置きつつ、必要に応じて繰り返します。 ろ過プロセスを監視します。必要に応じて圧力とろ過速度を測定し、記録します。圧力は20 psiを超えないようにしてください。これは、ろ過速度は2.0 L / minを超えてはならないことをお勧めします。それが残留ボトルの水の体積は、それが空にすることが決して起きないように監視することが重要です。ボリュームが増加したり、わずかに減少することは正常です。残留液ボトルの水の量は完全に下の3分の1を下回る場合は、残留ボトルラインのベントキャップを閉じピンチクランプを取り外します2。約2/3完全に戻ってボリュームを持って、クランプを開き、すぐに密封性を確保、ベントキャップを交換します。残留液ボトルのボリュームを迅速かつ継続的に低下した場合は、残留ボトルの蓋がタイトで、ベントキャップが所定の位置にしっかりとあり、tubiことを確認してくださいngは、水試料との接触のままです。これらの問題が発生していない場合は、それが残留ボトルの蓋のシールが不良であり、交換する必要がある可能性があります。 試料容器が空になったら、すぐに近くにピンチクランプ1は、その最大値の20％にポンプ速度を低減し、残留液ボトルからベントキャップを取り外し、ランプクランプを閉じます。 ランプクランプを締めたり緩めて約200mlに濃縮水ボトルのサンプルの音量を調整します。量が約200mlになった後、溶出ステップ（1.11から1.12）のランプクランプを締めます。 試料容器に溶出液500mlを追加して、コンテナの内部をすすぎます。溶出液を含む容器にサンプル取り込みラインに接続された10 mlのピ​​ペットを配置します。ランプクランプが閉じていることを確認します。オープンピンチ溶出液を描画するために一時的に1に近いピンチクランプ2をクランプします。 溶出液500mlを策定された後、近く、ピンチクランプ1とオープンピンチクランプ2。溶出液は、その最大値の20％のポンプ速度で5分間循環させることができます。 廃液ラインのランプクランプを締めたり緩めて約100mlに濃縮水ボトルのサンプルの音量を調整します。ランプクランプを締めて、サンプルが1分間循環させることができます。残留瓶にサンプルの体積を確保することによって、チューブに空気を引っ張って避けて残留液ボトルを入力してL / S 15チューブをカバーするのに十分な高さです。 残留瓶に試料を強制的にポンプの方向を反​​転させます。ポンプが残留瓶の中に〜225ミリリットルの合計で20秒間逆に実行することができます。ポンプの電源をオフにします。 ポンプヘッドからMasterflex I / P 73チューブを外し、圧力計を外します。中空糸限外ろ過を終了Masterflex L / S 24チューブを外します。に任意の残りのサンプルを強制的に残留ボトル上記のチューブを保持するボトルを残留。 ボトルからすべてのチューブを外し、非通気キャップベントキャップを交換します。 〜225ミリリットルの残留とIMS / IFAの手順に進みます。 2。免疫分離の手順バッファーおよび溶液の調製： クリプトスポリジウム/ジアルジアのコンボキットは室温に到達する：ダイナに含まれているバッファができます。 1X SL-バッファー：10X SL-バッファーに9 mlの試薬グレード水1 mlを追加します。 残留液ボトルからラベル250ミリリットルコニカル遠心チューブに液体の〜225ミリリットルを転送します。試薬水10mLで2回残留ボトルをすすぎ、円錐遠心管にすすぎを追加します。 4℃、15分ブレーキなしのCは1500×gで懸濁液を遠心分離する。 慎重にペレットボリュームのすべての0.5ミリリットル（すなわち吸引1に、空気 – 水界面からパックペレット上記5mlに上清を吸引5 1.3 mlのペレットの体積上記ミリリットル、0.5 ml以下のペレットを5 mlに吸引）。 ボルテックス、および/またはピペット混合することにより上清中にペレットを再懸濁します。 1ミリリットル10X SL-バッファーおよび10X SL-バッファーBの各試薬水2.5 mlで2回コニカル遠心チューブを洗浄し、すすぎに追加を含むフラット両面Dynal社L10チューブに液体の各5 mlのボリュームを転送L10チューブ、バッファを含む、12ミリリットルにL10チューブの総ボリュームをもたらします。 L10チューブに100μlをよく混合し、再懸濁し、抗クリプトスポリジウムとジアルジア抗ダイナビーズをそれぞれ追加します。ローテータミキサーで室温で1時間18 rpmでL10チューブを回転させます。 MPC-6マグネットとそっと手をロックで2分間チューブはエンドツーエンドの、180°に対してL10チューブの平らな面に置きます。 MPC-6までの磁石側と磁石、離れてビーズ/からの上清をデカント（OO）嚢胞錯体BouのL10チューブを保持する磁石を購入する。磁石からL10チューブを外し、チューブに1×SL-バッファー0.5 mlを加える。縦位置で磁石をMPC-Sで開催された1.5 mlのマイクロチューブに1×SL-バッファー0.5mlのつの追加リンスを使用して懸濁液を移す。 穏やかに1分間MPC-Sマグネット180°にチューブを揺する。代わりに磁石で、遠心チューブの底に向けパスツールピペットを用いて上清を吸引除去する。 マイクロ遠心チューブの前面側に1X PBSを1 ml添加し、マグネットを削除して、ビーズを再懸濁しているだけになるまで穏やかにチューブを揺する。垂直位置に磁石を取り付けて、穏やかに1分間チューブを180°を揺する。 PBSは、できるだけ多くの破片のように削除するには、パスツールピペットを用いて、ビーズペレットを乱すことなく、リンス吸引除去する。 マグネットを取り外し、マイクロ遠心チューブの裏面に試薬水50μlを加える。ボルテックス50秒間フルスピードでチューブ、その後、30秒の渦に続いて10分間80℃でチューブをインキュベートします。マグネットビーズを結合し、液体中で（OO）嚢胞を残して、斜めの位置にMPC-Sに磁石を交換してください。 SingleSpotよくスライドに（OO）嚢胞懸濁液を適用します。 第一解離を含む同じウェルに液体を適用すると、ステップ2.10を繰り返します。 37°Cのスライドもスライドに懸濁液を乾燥させる1時間の​​ウォーマーの上に置きスライドさせます。 3。染色試験バッファーおよび溶液の調製： DAPI溶液を操作する：1X PBS 25 mlにDAPIストック溶液（メタノールで2 mg / ml）を25μlのを追加します。店舗の在庫と1°C、暗所で10°Cの間に働くソリューションを提供しています。 よくスライドにメタノール50μlを適用して室温で乾燥させます。 よくスライドに取り組んでDAPI溶液50μlを加え、室温で2分間インキュベートします。 Kimwiを使用します。井戸からDAPIを芯に、PE。 EasyStain 50μlを適用します。 30分間35℃でインキュベートします。 キムワイプでよくオフ染色し、その後徐々にそれがよくエッジ上に流すため、冷たいEasyStain固定バッファー300μlを加えるウィック。室温で2分間インキュベートします。 井戸からバッファを芯とEasyStain封入剤10μlを適用するためにキムワイプを使用しています。 慎重に発生した気泡を除去し、カバースリップを適用します。透明なマニキュアでカバースリップをシールします。 オーシスト、または嚢胞似ている卵形または球形のリンゴ緑色蛍光のオブジェクトに対して、200X合計倍率で、FITCフィルターを用いてスライド全体をスキャンします。また、1000X総合倍率で、1000X総合倍率でDAPIフィルタを使用して、その後DICとそのようなすべてのオブジェクトを調べます。キャリブレーション接眼マイクロメータと形態的特徴を使用してサイズを記録します。 ドキュメントの結果。 注：追加の情元のプロシージャについての報はEPAメソッド1623年12 2005年12月版に記載されています。説明したタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過手順は、EPAメソッド1623の12.0項の代わりに使用されます。熱解離は、EPAメソッド1623のセクション13.3.3を変更します。また、この手順では、追加のPBSは、セクション13.3.2.16後にメソッド1623年12月2005バージョンに挿入することができますIMSプロセス中にリンスを説明します。これらの変更を含むEPAメソッド1623のために使用する消耗品、試薬、機器の完全なリストは、機器リストに記載されています。 4。代表的な結果濾過および免疫分離のプロセスを経て回復クリプトスポリジウムのオーシストとジアルジアのシストは、顕微鏡分析によって検出されます。 200X総合倍率は、 図2に示すように、典型的な染色パターン、サイズ、形状を示すそれぞれの生物において</stronG>さらに1000X総合倍率で油浸を用いて観察する必要があります。これは典型的な定義の機能または正の識別排除するだろう非定型の特徴のいずれかの測定と識別を可能にする。 クリプトスポリジウムは明るく強調表示されたエッジ（ 図3Aと鮮やかな青リンゴ色のFITCの蛍光を示す球状のオブジェクトへの卵は直径4から6μmである。）緑のリムと、明確な核（DAPI負）、濃いブルーの内部染色、または最大4つの別個の、スカイブルーの核（DAPIと水色内部の染色：DAPI UVと、オーシストは、次のような一般的な機能のいずれかのカテゴリを示します。正- 図3B）。非定型の特徴は、色の偏差、構造、またはDAPI蛍光（例えば、あまりにも多くの染色された核、赤色蛍光の内部構造）が含まれています。蛍光オブジェクトは典型的なFITCおよびDAPI染色のための基準を満たしている場合は、それは微分干渉CONを用いて検討しているtrast（DIC）。オブジェクトは、細胞壁の装飾、またはセルを埋める1つまたは2つの大きな核として非定型の外部または内部の形態的特徴を検討している。非定型的な構造が観察されない場合、オブジェクトは合計IFAのカウントに記録され、空のアモルファス構造として、あるいは現在の一から四スポロゾイト（ 図3C）と分類されます。同様に、 ジアルジアのようなオブジェクトは、FITCおよびDAPI染色などaxonemes、中央機関、および核のようなDIC特性に関して検討されジアルジアのシストは卵形の青リンゴ色の鮮やかなオブジェクトは、8へのラウンドです- 。5で長い18μmで- 15μmで明るく強調表示されたエッジ（ 図3D）広い。 DAPI UVで、 ジアルジアのシストは、DAPI染色陰性、またはDAPI陽性特性（ 図3E）出展いたします。蛍光オブジェクトは、 クリプトスポリジウムについての説明と同じ方法で、典型的な非定型機能のDICによって検討されています。非定型の特徴が観察されない場合、オブジェクトは合計IFAのカウントに記録され、空を含有する非晶質構造体として、または本の内部構造（ 図3F）の1つまたは複数のタイプに分類されています。 非定型の特徴を持っていることが観察されているすべての生物は、（OO）嚢胞としてカウントすべきではありません。環境試料の顕微鏡分析は、自動蛍光またはFITC結合抗クリプトスポリジウムおよび/ ​​または抗ジアルジア抗体1と交差反応する可能性があり、生物が存在するので、挑戦することができます。それはアナリストがCryptosporidiumおよび Giardia を識別する経験を得るために水生微生物やスライドのレビュー数十に精通することをお勧めします。陽性コントロールスライド上の少なくとも3（OO）嚢胞は顕微鏡で前のセッションごとに特徴づけされるべきである。 品質管理のサンプルは、％のRECを決定するために（OO）嚢胞でスパイクすることができ計算を使用して、各原虫のためにオーヴェリー： （OO）シスト回収率=（（QCサンプル数-ピーク値比較サンプルからカウント）/スパイク）×100。 図1。タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過システムのグラフィック表現。チューブを支援するために色分けされているシステムのアセンブリです。 図2。Cryptosporidium および Giardia（OO）嚢胞の代表的な蛍光画像。 クリプトスポリジウムのオーシストとジアルジアのシストは、FITC標識抗クリプトスポリジウム / ジアルジア抗体で染色した。矢印は、 ジアルジアのシスト、矢印、 クリプトスポリジウムオーシスト。 4 クリプトスポリジウムオーシストとジアルジア 6嚢胞の合計は、焦点面で発見された。サンプルobserv200X倍率下編。 。特性評価に使用するクリプトスポリジウムオーシストとGiaridia嚢胞の 図3に代表的な顕微鏡画像クリプトスポリジウムのオーシスト（A – C）。球状​​のオブジェクトの鮮やかな青リンゴ色のFITC蛍光の四季、スカイブルーDAPI核（B）とオーシストごとに一から四スポロゾイト（S）（C）までを含む明るく強調表示されたエッジ（）で、直径4から6ミクロン。 ジアルジアのシスト（D – F）。卵形のオブジェクトへの円形の華麗な青リンゴ色のFITC蛍光を8から5、長さ18μm – 明るく強調表示されたエッジを持つ広い15μmの（D）は、4つの空色DAPI核（E）までを含む、このような1または複数の識別可能な内部構造を持つ核（N）、中央体（M）とするかaxonemes（A）〜（F）など。白い矢印は、鮮やかなアップルグリーン蛍光染色クリプトスポリジウムのオーシストとジアルジアシストワットalls、白矢印、DAPI陽性の核。サンプルは1000X倍率で観察した。