Bir<em> In vitro</emOkumak> Co-enfeksiyon Modeli<em> Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde>-HIV-1 Etkileşimleri

Not: HIV-1 ve Plasmodium falciparum ile deneyler uygun biyogüvenlik düzeyi laboratuarlarda yapılmalıdır (parazitler için BSL2 ve BSL3 HIV-1 ve ko-enfeksiyon) ve potansiyel enfekte insan kanı kullanırken özel önlem alınmalıdır. 1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) Arınma (8 ve 9 dayanarak) Antikoagülan (heparin, sitrat, asit sitrat, dekstroz ya sitrat fosfat dekstroz) ile muamele sağlıklı donörlerden (500 ml) taze insan kanı ile başlar. Arındırıcı ve tecrit PBMC ve protokol geri kalanı boyunca ne zaman endotoksin ücretsiz reaktifler kullanın. % 70 etanol ile tüp dahil olmak üzere kan torbası, dezenfekte, tüpü kesip dikkatli bir T150 balona kan aktarın. 50 ml konik tüp (Ficoll oda sıcaklığına ulaştığını emin olun) başına 15 ml Lenfositler Ayırma Orta (Ficoll) 16 tüpleri hazırlayın.Üstüne taze kan dikkatlice tabakası 30 ml. 20 30 dakika için 400 xg'de Santrifüj ° off sonları ile C. Santrifüj içinde, tüp başına oda sıcaklığında Hank'in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 25 ml ile 8 x 50 ml konik bir tüp hazırlanır. Dikkatle HBSS (tüp başına havuzu 2 hücre halkalar) içeren 50 ml tüp için arayüzünde bulutlu hücre halkası (PBMC içerir) aktarın. HBSS ile 50 ml'ye birimleri tamamlayın. 20 az 15 dakika boyunca 150 xg'de Santrifüj ° molalar C. Bulanık hücre halkasının santrifüjleme sırasında, Ficoll adımı, bir 50 ml konik bir tüp doldurmak için havuz plazmadan sarı bir üst katman toplayabilir. ° C'de 30 dakika süre ile 1800 x g'de 10 dakika dönmeye 56 at 50 ml tüp ısıtarak plazmada tamamlayıcı inaktive. Supernatant (aşamadan sonra orta takviyesi olarak kullanılabilir içeren seyreltilmiş otolog plazma) tutun. Dikkatle süpernatan ve resuspen kaldırmakd 50 ml tüp başına HBSS ve havuz 2 pelet 25 ml adım 1.7 'den hücre peleti. 20 ° C'de 8 dk boyunca 300 xg'de Spin Dikkatle süpernatantı ve bir 50 ml tüp içinde 10 ml HBSS ve havuzdaki peletler tekrar süspansiyon. , Bir kısım atın ölüm değerlendirmek için tripan mavi dışlama gerçekleştirmek ve sonra PBMC sayarız. HBSS ve 300 x g hızında 10 dakika döndürme ile 50 ml tam hacim. Süpernatant kaldırmak ve (bir 500 ml kan 400-500 x 10 6 PBMC yaklaşık almalıdır) 5×10 6 hücre / ml 'de RPMI 1640 içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 2. Monositler-Türetilmiş Makrofajlar (MDM) Farklılaşma (8 ve 9 dayanarak) RPMI 1640 (25 ml / çanak) ile 15 cm yemekleri Tohum yaklaşık 1.25 x 10 8 PBMC. Hücreler% 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C'de 1-2 saat boyunca izin yapışır. Yeni bir balon içerisinde olmayan yapışık hücreleri aktarın ve 15 ml endotoksin içermeyen PBS iki kez (5 plaka yıkayındak, 300 x g). Yapıştırılır hücreler izole monositler vardır. Taze izole monositler MDM içine ayırt etmek için izin vermek için,% 5 otolog plazma (adım 1.8) ilave edilmiş RPMI 1640 ortamında, 20 ml ekleyin. Rekombinant insan makrofaj koloni stimüle edici faktör (M-CSF, 25 ng / ml) ve penisilin / streptomisin çözeltisi (PS, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin) eklenir. 2 gün boyunca inkübe, orta değiştirmek ve 37% 5 ° C CO 2 atmosferinde 2-3 ekstra gün inkübe edin. Eski orta çıkarın ve endotoksin içermeyen PBS bir kez yıkayın, PBS yavaşça ekleyin ve hemen emdiriniz. Tamamen ayırt MDM ayırmak için, bir% 5 CO 37 ° C'de 15-20 dakika için ~ 7 ml Accutase (Accutase, plastik çanak gelen hücrelerinin ayrılması izin proteaz ve kollajenolitik aktivitesinin bir ticari olarak temin karışımı) ile muamele hücreleri 2 atmosfer, orta zaman hafifçe sallayın. (Hücrelerin korunmasına yardımcı olmak için ise her plaka 3-5 ml otolog plazma (Adım 1.8) ekle) kazıma. Yavaşça orta 50 ml'lik bir tüp içinde her zaman ve transfer / havuzda hücrelerini kapsayan emin hücreleri kazıyın. Mümkün olduğunca çok hücre kurtarmak için endotoksin içermeyen PBS ile plakalar durulayın. Süpernatant atmak, 200 xg'de 5 dakika Spin. 5 ml MDM kültür ortamı (RPMI 1640% 10 tamamlayıcı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (iFBS), PS, 25 mM HEPES ile desteklenmiş) ve sayım hücreleri (MDM toplam PBMC genellikle 2-8 verim:%) içinde Pastör pipetiyle pelet. Not: MDM bir kısım akım sitometri ile hücre popülasyonu saflık değerlendirmek için bu adımı alınabilecek; genellikle% 99 MDM ekspres CD14 aldı. 24-iyi plaka iyi başına MDM kültür ortamı 600 ul Tohumculuk 1×10 5 MDM. Enfeksiyonların önce bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir. 3. HIV-1 viral Stoklar Üretim ve kantitasyonu HEK293T hücreleri Follo kalsiyum fosfat transfeksiyon kullanarak viral stoklar üretinFortin ve ark kanat protokolü. 10. R pHCMV-G + ve 10 ug veya NL4.3 Luc 15 ug – ya NL4.3 Luc + Env 20 ug ile lusiferaz kodlama raportör genini içeren tek bir döngü virüsler, ko-transfekte HEK293T hücreler elde etmek için + Env – R + ve pJRFL env 15 g. + Kontrol glikoprotein eksikliği olan virüsler üretmek için Ar – NL4.3 Luc + Env 30 mikrogram kullanın. Tam replikatif virüsü için NL4.3Bal env 30 ug kullanın. Vektörler pHCMV-G ve pJRFL env sırasıyla, veziküler stomatit virüs zarf glikoprotein (VSV-G) kodlamak ve CXCR5-tropik HIV-1 (NL4.3Bal env farklı) bir. Plazmit ile ilgili ek bilgi 8 elde edilebilir. Plazmidler NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı (NIAID, NIH) ile elde edilebilir. HIV-1 p24 kapsid proteini 11 için ELISA yöntemi ile tüm viral stokları ölçmekVe kullanmadan önce bunların potansiyel bulaşıcı doğrulayın. Biz TZM-bl göstergesi hücrelerin 12 kullanımı yoluyla virüs stoklarının enfektivite değerlendirmek. 4. Plasmodium falciparum Parazitler Kültür (13 dayanarak) Parazitlerin 4.1 Genel kültür ve bakım P. koruyun % 0.5 (w / v) Albumax II, 25 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640% 4'lük bir hematokrit (25 mM HEPES ve 25 mM NaHCO 3 ile tamponlanmış) de, insan eritrositleri (O kan grubuna +) içinde falciparum 3D7 asexual aşaması parazitler 37 ve at 370μM Hipoksantin azot içinde% 1 oksijen /% 5 karbon dioksit gazı, bir karışımı içinde ° C. Parazitemi kültürünün ince yayma yapma ve% 15 Giemsa solüsyonu ile boyanarak izlenebilir. Parazitler bir kontrol olarak kullanmak için her zaman olduğu gibi aynı koşullarda bulaşmamış kırmızı kan hücreleri (uRBC) kültürü çanak tutmak. Geç dönem parasit elde etmek içines (trofozoit / erken şizont), aşağıdaki gibi parazitler senkronize: 4.2 Parazit senkronizasyon Sabah, 300 xg'de, spin 5 dk parazit kültürü hasat ve supernatant atın. % 5 (a / h) 37 ° D-sorbitol ve inkübe 5 dakika ile 5 ° C hematokrit in Pastör pipetiyle pelet 300 x g hızında 5 dakika çevirin, 30 ml kültür ortamı içinde yüzen, Pastör pipetiyle pelet atmak ve inkübatör geri koyun. Yaklaşık 8 saat sonra, tekrar sıkıca senkronize parazitleri almak için 4.2.3 4.2.1 adımları yineleyin. Geç evre parazitler (trofozoit / erken şizont) sonra deney gerçekleştirmek için ertesi sabah hasat edilebilir. Önce arıtma için, yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için Giemsa boyama gerçekleştirin. 4.3 Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücreleri (iRBC) arıtma % 70 etanol ve p VarioMacs ayırıcı (stand ve mıknatıs) sterilizebiyolojik başlık altında dantel. CS sütunun altına üç yollu Fix. Miltenyi özel kesici iğne plastik koruyucusu sonunda kesin ve musluk altına iğne düzeltmek. Dikkatli bir mıknatıs içine sütun kilitleyin. Yavaş stopcock sol tarafında vidalı kiti-ekteki şırınga ile MDM kültür ortamı 10 ml enjekte edilerek sütundaki tüm hava kabarcıkları çıkarın. ~ 20 ml MDM besiyeri ile sütun yıkayın. Kültürü plakası ile hasat alyuvar, 10 ml MDM ortamı (300 x g, 5 dakika) ile bir kez yıka, 12 ml MDM kültür ortamında RBC pelletini. Yavaşça sütun eklemek ve (trofozoit veya şizont aşamada parazit içeren enfekte kırmızı kan hücreleri nedeniyle hemozoin kristallerinin varlığı manyetik alan tarafından muhafaza edilecektir) ile süspansiyon akmasına izin ver. 20 ml besiyeri ile bir kez yıkayın ve sütun üstüne beyaz disk ulaştığında sıvı akışı durur. 12 ml MDM kültür ortamı ile temiz bir steril bir tüp içinde manyetik ve elüt edilmesi iRBC den Sütun çıkarın. Smear, bir geri iRBC bir tablet ve Giemsa yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için boyama gerçekleştirin. Bir haemocytometer (izole RBC% 100 iRBC vardır) kullanılarak geri iRBC sayın. Pelet hücreleri (300 xg, 5 dk), süpernatant atın ve 500 ul taze AB + insan serum (opsonisation adım 14) ile hücre tedavisi. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir. Istenen konsantrasyonuna iRBC 10 ml MDM kültür ortamına (300 x g, 5 dakika), ve Pastör pipetiyle ile bir kez yıka. Genellikle,% 10 parazitemi 15 cm kültür çanak kabaca ~ 0.5-1×10 8 sıkıca senkronize iRBC verir. 5.. Plasmodium falciparum için MDM Pozlama 75:1 MDM: uRBC ya iRBC için MDM ortaya çıkarmak için, hücreler uRBC / iRBC bir oranı elde etmek için MDM kültür ortamı içinde tekrar süspanse edilmesi gerekir. Daha önce deMDM içeren hazırlanmış 24-iyi plakaları, her kuyuya uygun eritrosit süspansiyonu hacmi ekleyin. Üç nüsha halinde tüm deney yapın. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 4 saat süreyle inkübe co-kültürler. Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. Geriye kalan eritrosit lyse için, 20 sn ve aspirasyon için buz steril su, 200 ul ilave edilerek kuyu yıkanır. 600 ul kültür ortamı MDM ekleyin ve bir 5% 2 CO atmosferinde 37 ° C 'de 24 saat inkübe edilir. 6. Bir Tam Replikatif HIV-1 ile MDM Enfeksiyon P. etkisini değerlendirmek için MDM HIV-1 çoğaltma falciparum, Şekil 1A, uygun kuyulara NL4.3Bal env virüslerin p24 ve 10 ng (MDM ortam 300 ul içinde) belirtilen şemasına göre, eklemek; kontrolü kuyu sadece orta MDM ekleme . Bir 5 içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe% 2 atmosfer CO. Endotoksin içermeyen PBS 3 kez hücre yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edilir. Gün 3, 6, 9 ve 12 hasat daha sonra taze MDM orta 200 ul ekleyerek, her bir 200 ul süpernatan, viral enfeksiyonun başlangıç ​​takiben. Fortin ve ark. 10 takiben, ELISA ile büyük HIV-1 kapsid p24 proteini kantitatif için -20 ° C 'de hasat edilmiş süpernatanlar tutmak. 7. Tek Döngü Virüs Kodlama Lusiferaz ile MDM Enfeksiyon R + (- MDM HIV-1 gen ifadesi üzerindeki etkisi parazit belirlemek amacıyla, 10 ng p24 (MDM orta 300 ul içinde) NL4.3 Luc + Env birinin, Şekil 1B özetlenen şemasına göre, ekleme VSV-G), NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env) veya NL4.3 Luc +Env – ilgili kuyularda R + virüsler. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 2 saat inkübe. Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edilir. Orta 72 saat aşağıdaki enfeksiyonu temizlemek ve lizis tamponu 1X (lusiferaz kit ile birlikte) 200 ul ekleyin. Hücreler nazik çalkalama ile oda sıcaklığında lyse edelim. -20 ° C de saklayınız Plaka çözülme ve 96-iyi luminometre plakasına lizatı 40 ul aktarmak; lusiferaz substrat 100 ul (lusiferaz kit ile birlikte) ekleyin ve üreticinin talimatlarına bir luminometreye lusiferaz (Ateşböceği lusiferaz) aktivitesini ölçmek. 8. Temsilcisi Sonuçlar Co-enfeksiyon modeli kullanarak, bu exposur göstermekP. e MDM için falciparum HIV-1 enfeksiyonu onların duyarlılık azalır. Gerçekten de, önemli bir azalma (p <0.05; 2 yönlü ANOVA, günde 12) olarak süpernatant HIV-1 p24 kapsid proteini ile ölçülen viral parçacıkların, sürümünde, parazitler (Şekil 2A) ile ön tedavi MDM görülmektedir. Bu gözlem, bir lusiferaz-raportör gen kodlayan virüsler tarafından enfekte olmuş hücrelerin içinde onaylanır. Eksojen VSV-G veya HIV-1 glikoprotein ya barındıran bu tür virüsleri ile MDM enfeksiyonu P. maruz kalan hücrelerdeki düşük (p <0.05, Student t-testi) daha az lusiferaz üretime yol açar falciparum (Şekil 2B). Bu VSV-G-pseudotyped virüsler bunların JRFLenv muadilleri den çok daha büyük lusiferaz aktivitesi vermiştir dikkati çekmektedir; Bu VSV parçacıkları-G pseudotyped 15 arasında daha büyük verimlilik enfeksiyonu nedeniyle. Parazit fuar MDM etkileri virüsler, her iki tür, bu viral gen eski bazı adımı etkilediğini düşündürmektedir göz önüne alındığındapression (Şekil 2B). Bu kadar hücre canlılığı gözlenen inhibisyon hücre ölüm nedeniyle belli değil, belirten, iRBC (veriler gösterilmemiştir) MDM fuar etkilenmedi söz etmek de önemlidir. Şekil 1.. Tam replikatif virüs MDM enfeksiyonu için) Levha şeması Mock:. Olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin maruz kalan hücreler. Bal:. NL4.3Bal env Bal / uRBC ile enfekte hücreler: Hücre uRBC maruz kalan ve NL4.3Bal env Bal / iRBC ile enfekte:.. MDM enfeksiyon için iRBC ve NL4.3Bal env B ile enfekte maruz kalan hücreleri) Levha şeması ile tek çevrim lusiferaz kodlama virüs Mock:. olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: hücreleri Plasmodium falciparum-i maruzkırmızı kan hücreleri nfected. Δenv: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler – R + JRFL:. NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler – R + (env JRFL). vsv-g: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin – R + (vsv-g) Δenv / uRBC:.. hücreleri uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC ile enfekte: hücreleri iRBC maruz ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte – R + JRFL / uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin – R + (JRFL env.). JRFL / iRBC: iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin – R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin – R + (vsv-g) vsv-g/iRBC:. hücreleri iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte – R + (VSV-g). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> Şekil 2. . 4 saat MDM) ve yaygın yıkanmış: A MDM HIV-1 viral üretim Plasmodium falciparum ile) Etkisi MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC maruz bırakıldı. Hücreler 2 saat boyunca p24 NL4.3Bal env 10ng ile enfekte edilmiştir. Viral üretimi başlangıç ​​viral enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında hücre içermeyen yüzer kısım, HIV-1 p24 için ELISA ile takip edildi. . Bir temsilci deney MDM HIV-1 viral transkripsiyon üzerine Plasmodium falciparum B) etkisi gösterilmiştir MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC ile enfekte edildi. MDM). Luc + Env R + (JRFL env) veya NL4.3 – – R +, NL4.3 Luc + Env – Hücreler daha sonra tek çevrim virüs p24 ile 10ng (ya NL4.3 Luc + Env ile enfekte olan R + (vsv- g)). Lusiferaz ifade hücre ilk virüs enfeksiyonunu takiben 72 saat lizatları değerlendirildi. Temsili bir deneyde gösterilmiştir.