علم الوراثة العكسية الاسترداد بوساطة من نوروفيروس الفئران المعدية
Summary
Noroviruses هي أحد الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والأمعاء بعد التقنيات الجزيئية لتوصيف هذه لا تزال جديدة نسبيا. نحن هنا نورد مختلفين عكس نهج الوراثة لاستعادة كفاءة نوروفيروس الفئران (MNV)، العضو الوحيد من هذا جنس والتي يمكن نشرها في ثقافة الخلية.
Abstract
noroviruses الإنسان هي المسؤولة عن معظم حالات التهاب المعدة والأمعاء البشرية (GE) في جميع أنحاء العالم، وهي مشكلة متكررة في البيئات التي لا يمكن فيها وثيقة من شخص إلى شخص الاتصال يمكن تجنبها 1 و 2. خلال السنوات القليلة الماضية تم الإبلاغ عن حدوث زيادة في معدل انتشار المرض في المستشفيات، مما تسبب في اضطرابات كبيرة في قدرتها التشغيلية، فضلا عن خسائر اقتصادية كبيرة. وقد اقتصرت على تحديد نهج جديد للفيروسات نظرا لعدم قدرة noroviruses الإنسان لإكمال عدوى الإنتاجية في زراعة الخلايا 3. وقد فتحت ويمكن عزل مؤخرا من نوروفيروس الفئران (MNV)، ترتبط ارتباطا وثيقا نوروفيروس الإنسان (4) ولكن الذي نشر في الخلايا 5 آفاقا جديدة للتحقيق في هذه الممرضة 6 و 7.
النتائج تكرار MNV في تركيب جديد الجينومية بالمعنى الإيجابي وsubgenomic جزيئات الحمض النووي الريبي، وهذه الأخيرة والتي تتطابق مع ثي مشاركةالثالث من الجينوم الفيروسي (الشكل 1). MNV يحتوي على أربعة أنواع مختلفة من إطارات القراءة المفتوحة (ORFs)، والتي تحتل معظم ORF1 من الجينوم وبترميز 7 غير الهيكلية البروتينات (NS1-7) أفرج عنه من تمهيدا polyprotein. وترد ORF2 وORF3 داخل المنطقة RNA subgenomic وترميز البروتينات قفيصة (VP1 وVP2، على التوالي) (الشكل 1). مؤخرا، حددنا أن ORF4 إضافية تداخل ORF2 لكن في إطار قراءة مختلفة وظيفية وتشفير لعامل الفوعة المترجمة الميتوكوندريا (VF1) 8.
النسخ المتماثل للشعور إيجابي فيروسات الحمض النووي الريبي، بما في ذلك noroviruses، يحدث في السيتوبلازم مما أدى إلى توليف جينوم الحمض النووي الريبي جديدة لم يسبق لهم اللعب. لتشجيع ترجمة الفيروسية والفيروسات استغلال الاستراتيجيات المختلفة التي تهدف إلى توظيف تصنيع البروتين الخلوي آلية 9-11. ومن المثير للاهتمام، هو الدافع ترجمة نوروفيروس من VPG البروتين الفيروسي التمهيدي متعددة الوظائفمرتبطة تساهميا إلى نهاية 5 'من كلا RNAs والجينومية وsubgenomic 12-14. هذه الآلية المتطورة للترجمة من المرجح أن يكون عاملا رئيسيا في كفاءة محدودة من الانتعاش الفيروسية بواسطة التقليدية نهج الوراثة العكسية.
نحن هنا نورد استراتيجيتين مختلفتين استنادا إلى جيل من الفئران 1-نوروفيروس (المشار إليها باسم MNV طيه) محاضر توج في نهاية 5 '. إحدى الطرق ينطوي على حد سواء في تركيب المختبر، ووضع حد أعلى من الحمض النووي الريبي الفيروسي، في حين أن النهج الثاني ينطوي على نسخ من MNV [كدنا] في الخلايا معربا عن T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي. وقد وفرت من توافر هذه الأنظمة الوراثة العكسية لدراسة MNV ونموذج الحيوان الصغير قدرة غير مسبوقة لشرح دور تسلسلات فيروسية في تكرار والمرضية 15-17.
Protocol
1. رنا النسخ والسد لاستعادة MNV المعدية ويهدف هذا البروتوكول للسماح للانتعاش كفاءة MNV المعدية من [كدنا] في المختبر عن طريق النسخ واللاحقة لها في المختبر متوجا (القسم 1.1). وtransfected ثم النصوص الناتجة توج في الخلايا لاسترداد MNV المعدية (المقاطع 1.2 و 1.3). هذا النهج يوفر الأسلوب الأكثر حساسية من أجل استرداد MNV مع غلة نموذجي في أكثر من 10 5 وحدات المعدية بنسبة 35 ملم (في قطر)، طبق من الخلايا لMNV. هو مفصل في البروتوكول فيما يلي: 1.1 تجميع النصوص المعدية MNV توج: هضم البلازميد الذي يحتوي على نوع البرية MNV [كدنا] (pT7: MNV 3'Rz) مع Nhe أنا على الحصول على الحمض النووي خطي Nhe أنا يعترف تقييد موقع فريد من نوعه بعد 3 'نهاية polyA ذيل الجينوم MNV (الشكل 2). ويجري تنقية عادة البلازميدات Linearisedمع استخدام أعمدة السيليكا (على سبيل المثال GFX جل DNA PCR الفرقة مجموعة من تنقية للرعاية الصحية GE) و مزال في H 2 O. في المختبر نسخ الموجه linearised T7 باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز كما هو موضح سابقا 17. مجموعات تجارية عديدة متاحة لهذا الغرض وتوفير وسيلة للتكرار كميات كبيرة من تركيب الحمض النووي الريبي مثل MEGAScript (تقنيات الحياة) وRiboMAX (Promega). وعادة ما تكون ردود الفعل النسخ الدناز هضمها قبل إجراء مزيد من التحليل، ولكن في كثير من الحالات هذا غير مطلوب وتنقية كلوريد الليثيوم كما هو موضح أدناه لا يعجل الحمض النووي بشكل فعال. تحليل قسامة صغيرة من رد فعل نسخ الحمض النووي الريبي، وعادة ما عملت 0.5 ميكرو لتر أو أقل، من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز لضمان رد فعل النسخ بكفاءة والحمض النووي الريبي هو كامل طول. بينما العديد من المستخدمين قد ترغب في تشغيل تبديل طبيعة المواد الهلامية إلى حجم بشكل صحيح الحمض النووي الريبي، ونحن عادة استخدام غير تبديل طبيعة الاغاروز هلام electrophorESIS وسيلة سريعة لتحليل الحمض النووي الريبي سلامة. الجينوم MNV تنتج كما من استنساخ [كدنا] المعدية pT7: سوف MNV 3'Rz تشغيل في ما يقرب من 3 KBP نسبة إلى سلم dsDNA على هلام الاغاروز عدم تبديل طبيعة (الشكل 3). نعتبر أن الوسائل الأخرى المتاحة كبديل للحصول على تحليل سريع لسلامة الحمض النووي الريبي مثل استخدام bioanalyser اجيلنت (الشكل 3). ملاحظة قد يكون واجه هذا القرار جل الفقيرة إذا تم تحميل الكثير من الحمض النووي الريبي. تأخذ اهتماما كبيرا لضمان استعداد هلام الاغاروز باستخدام ريبونوكلياز خالية من الكواشف لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي خلال الكهربائي الذي قد يؤثر على قرار الفرقة. تسخين الحمض النووي الريبي إلى 65 درجة مئوية تلاه تبريد على الجليد قد يساعد أيضا في بعض الحالات. تنقية الحمض النووي الريبي عينة لإزالة النيوكليوتيدات الفردية. العديد من الأساليب المتاحة لهذا النهج السيليكا عمود بما في ذلك بناء ولكن في هذا البروتوكول، ونحن عادة استخدام كلوريد الليثيوم كبديل فعالة من حيث التكلفة. للهذا الغرض، إضافة H 2 O للتوصل إلى حجم نهائي قدره 100 ميكروليتر ثم إضافة 40 ميكرولتر من كلوريد ليثيوم حل هطول الأمطار (7.5 متر LiCl، 50 EDTA مم، درجة الحموضة 8.0، Ambion) وتخزين عينة على -20 درجة مئوية لمدة لا 30 دقيقة على الأقل. بيليه الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي في العاشر ز 12000 في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. إزالة طاف، مع الحرص على عدم تعكير صفو شفافة RNA بيليه، وأغسلها في 150 ميكروليتر من الإيثانول بنسبة 70٪. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب ز X 12000 في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إزالة الإيثانول والهواء الجاف في الحمض النووي الريبي، وتجنب بيليه لتجف تماما كما أن هذا سيجعل من الصعب إعادة تعليق. ثم، resuspend للنصوص MNV إلى 50-100 ميكرولتر من حل تخزين الحمض النووي الريبي (Ambion). وينبغي توخي الحذر لضمان جميع الحمض النووي الريبي قد حلت بشكل صحيح. ينبغي على الحمض النووي الريبي يبدو من الصعب حل تماما، تسخين العينة إلى 60 درجة مئوية قد تساعد على resuspend ذلك. وينبغي بعد ذلك أية مادة غير قابلة للذوبان يمكن إزالتها بذ الطرد المركزي قبل الجيش الملكي النيبالي الكمي. ولم يسبق لهم اللعب على محاضر تنقيته وتتطلب الخطوة اللاحقة في المختبر ليكون متوجا المعدية (ScriptCap نظام m7G السد، التكنولوجيات الحيوية Epicentre). قياس الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي. اعتمادا على طبيعة وحجم رد الفعل النسخ، والمحاصيل التقليدية وتتراوح 50-150 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل 100 رد فعل النسخ ميكرولتر. وينبغي تحليل سلامة الحمض النووي الريبي قبل رد الفعل من قبل متوجا ينفد 100-300 نانوغرام من عينة إلى هلام الاغاروز٪ 1 (الشكل 3). لتحسين كفاءة من الحمض النووي الريبي متوجا، والحرارة 60 حتي 70 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي MNV محاضر في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ومن ثم وضع أنبوب مباشرة على الجليد. قد تقلل هذه الخطوة أي تأثير كابح للبنية الحمض النووي الريبي على وضع حد أقصى. نبض أنبوب في microfuge مبردة لجمع قطرات تشكلت خلال الخطوة التدفئة. إعداد خليط التفاعل متوجا على النحو المقترح من قبل الشركة المصنعة (ScriptCap m7Gمتوجا النظام، التكنولوجيات الحيوية Epicentre). لفترة وجيزة، إضافة 60-70 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي MNV لحجم رد الفعل النهائي من 100 ميكروليتر. قد يكون رد فعل السد مزيج يحتوي على 10 ميكرولتر من 10 × السد العازلة (500 ملي TrisHCl درجة الحموضة 8.0، 60 مم بوكل، 12.5 مم MgCl2)، و 10 ميكرولتر من GTP 10 ملم، و 0.5 ميكرو لتر من 20 ملي S-adenosyl ميكرولتر، ميثيونين 2.5 من Scriptguard (100 وحدة)، و 4 ميكرولتر من أنزيم Scriptcap (40 وحدة). خلال رد فعل انشاء، والحفاظ على الجيش الملكي النيبالي النصوص على الجليد لتفادي التدهور. تخلط جيدا خليط التفاعل ومن ثم احتضان هذا في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ملاحظة قد يتم تحجيم حجم رد فعل وفقا لكمية من نص توج المطلوبة. تنقية الحمض النووي الريبي من قبل هطول الأمطار LiCl على النحو المبين أعلاه (انظر النقطة 1.1.6). حل بيليه في 50-100 ميكرولتر من حل تخزين الحمض النووي الريبي (Ambion) وقياس كمية الحمض النووي الريبي. عادة، يتم تطبيعها بعد ذلك عينات الحمض النووي الريبي إلى 1 ميكروغرام / ميكروليتر. مرة أخرى، وتحقق من كل الحمض النووي الريبي قد حلت بشكل صحيح. إذا لم يتم حل ذلك بشكل صحيح، والحرارة Tانه نموذج إلى 60 درجة مئوية للسماح انحلاله. إزالة بواسطة الطرد المركزي أي مواد غير قابلة للذوبان قبل الجيش الملكي النيبالي الكمي. تحقق من سلامة الحمض النووي الريبي مرة أخرى قبل الشروع في الخطوة ترنسفكأيشن. لتحقيق هذا الهدف، تشغيل مبلغ 100-300 نانوغرام من عينة إلى هلام الاغاروز٪ 1 (الشكل 3). 1،2 الاسترداد بواسطة النيون بوساطة ترنسفكأيشن من الحمض النووي الريبي إلى Raw264.7 الخلايا: لاسترداد virions MNV المعدية في خط خلية متساهل من الممكن electroporate نص توج MNV إلى Raw264.7 الخلايا باستخدام نظام ترنسفكأيشن النيون (إينفيتروجن). Raw264.7 هي الخلايا عرضة للإصابة MNV، ودعم جولات متعددة من تكاثر الفيروس واللاحقة إعادة العدوى. ونتيجة لذلك، فإن غلة نموذجي في الاقتراب أكثر من 10 5 وحدات المعدية لكل مل في 24 ترنسفكأيشن آخر ساعة الذروة لكن في> وحدات 7 10 معدية بعد 48 ساعة. قبل يوم واحد ترانsfection، والبذور Raw264.7 الخلايا في 1 confluency 50٪ المقدرة. وعادة ما يطلب من 2 T75 قوارير من الخلايا لمدة 3 transfections. يوم ترنسفكأيشن، كشط monolayers الخلية إلى النسر Dulbecco والمتوسطة معدلة (DMEM) التي تحتوي على 10٪ الجنين المصل في ربلة الساق (FCS)، وضمان يمكنك إنشاء تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting المتكررة. تحديد تركيز خلايا قابلة للحياة في haemocytometer باستخدام زرقة التريبان الاستبعاد لتسمية الخلايا غير قابلة للحياة. بيليه الخلايا في ز X 1200 لمدة 5 دقائق وresuspend لهم في DMEM تحتوي على السفح 10٪ عند تركيز النهائي من 8 × 10 6 خلية / مل. فقط قبل، ترنسفكأيشن 1 مل قسامة من الخلايا في ترنسفكأيشن وبيليه لهم في ز X 1200 لمدة 2 دقيقة. إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا في 500 ميكروليتر من PBS (دون 2 ملغ + / كا 2 +). تدور إلى أسفل مرة أخرى في الخلايا ز X 1200 لمدة 2 دقيقة. لاحظ أنه من المستحسن للحفاظ على الخلايا في DMEM لأطول فترة ممكنةكما يمكن تخزين في برنامج تلفزيوني لفترات طويلة من الزمن تعرض للخطر بقاء الخلية، ومعدل ترنسفكأيشن. إزالة برنامج تلفزيوني من الأنابيب وإضافة 130 ميكرولتر من حل إعادة تعليق (النيون عدة نظام ترنسفكأيشن، إينفيتروجن) إلى تركيز النهائي من 6 × 10 7 خلية / مل. ينبغي الحرص على resuspend الخلايا تجنب تشكيل الفقاعات التي سوف تسبب أثار خلال ترنسفكأيشن والتراضي بقاء الخلية. إضافة كمية مناسبة من نص MNV توج على الخلايا (الشكل 2)، يضاف عموما 1،3 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المغطاة إلى 130 ميكروليتر من الخلايا معلق وبلطف مختلطة. ثم، جمع 100 ميكروليتر من الخليط في 100 ميكروليتر النيون طرف ترنسفكأيشن. وينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان أن يتم تشكيل أي فقاعات في كوفيت electroporation (النيون عدة نظام ترنسفكأيشن 100 رأس ميكرولتر) وهذا سوف يسبب فشل التجربة. Electroporate الخلايا باستخدام نبضة واحدة في 1700 V لمدة 25 ميللي ثانية، ENsuring غياب الشرر خلال يتقطع والتي سوف تشير إلى وجود فقاعات في العينة. في حالة اثارة ينبغي أن يحدث، تجاهل العينة وتكرار ترنسفكأيشن. الافراج عن الخلايا في أنبوب إيبندورف التي تحتوي على 1 مل من المضادات الحيوية مجانا DMEM تحتوي على السفح 10٪. ملاحظة يمكن إعادة استخدامها كل طرف ما يصل الى ثلاث مرات مع عينة الحمض النووي الريبي نفسه إذا كانت هناك حاجة أعداد أكبر من الخلايا transfected. بعد ذلك، توزيع خلايا من الأنبوب في آبار مستقلة تحتوي على مبلغ مناسب من prewarmed DMEM مجانا المضادات الحيوية التي تحتوي على السفح 10٪. وكتوجيه عام، 150 ميكرولتر من تعليق خلية ولدت خلال الخطوة 1.2.8 تكفي لفترة واحدة أيضا من لوحة 24 طبق يحتوي على 0.5 مل من DMEM prewarmed، في حين أن 300 ميكروليتر مناسبة للبئر لوحة 12 طبق تحتوي على 1 مل من DMEM prewarmed. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 لمدة 24 إلى 72 ساعة. ثم، وإطلاق سراح virions المعدية من خلايا من جانب واحد (أو أكثر)تجميد ودورات ذوبان الجليد وتحديد عيار الفيروس في عينة الفحص باستخدام إما لوحة أو TCID50. لاحظ أنه ينبغي توضيح lysates بواسطة الطرد المركزي لمدة 1-2 دقائق على السرعة القصوى أو عن طريق التصفية من خلال مرشح ميكرومتر المسام 0.22 قبل المعايرة. عادة، MNV يصل titres من حوالي 1 × TCID50/ml 6 10 على 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وحتى 1 9 10 س في 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وتحدد عادة 3'Rz MNV بواسطة التسلسل الفيروسات ينجو من الموت بعد 2-5 مقاطع إضافية في Raw264.7 الخلايا: وجود واستقرار من الطفرات التي أدخلت في pT7. 1،3 الاسترداد بواسطة lipofection إلى خلايا BHK-21: وهناك طريقة أكثر مباشرة والتكاليف في كثير من الأحيان أكثر فعالية من أجل استرداد MNV المعدية من النصوص توج هو عن طريق lipofection (Lipofectamine 2000، إينفيتروجن). نظرا إلى أن Raw264.7 خلايا يصعب transfect باستخدام النهج القائمة على الدهون التي نتخذها عادة استخدام الغيرإيه السهل transfect خطوط الخلايا مثل BHK-21 الذي يشكل خط خلد المستمدة من الخلايا الليفية طفل الكلى الهامستر. كما نهج موحد في مختبرنا نستخدم BSR-T7 الخلايا، وهو مشتق من الخط BHK-21 خلية، في حين مثل هذه الخلايا من السهل transfect ودعم MNV تكرارها، وهي تفتقر إلى مستقبلات مناسبة للسماح عدة جولات من عودة المرض إلى الظهور . ونتيجة لذلك، فإن العائد فيروس المتولدة من هذا النظام هو مؤشر على دورة واحدة من تكاثر الفيروس. هذا النهج هو استخدام خاص عند دراسة أثر الطفرة في انتعاش فيروس لأنها تسمح التي يتعين القيام بها transfections متعددة في وقت وخفض التكاليف إلى حد كبير مقارنة مع النيون بوساطة ترنسفكأيشن وأيضا لا يحتاج إلى معدات متخصصة. تجدر الإشارة إلى أن خطوط الخلايا الأخرى المتاحة بسهولة مثل الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى أيضا أن تدعم الانتعاش الفعال للظروف MNV ترنسفكأيشن لكن ينبغي أولا أن يكون الأمثل لضمان كفاءة تسليم الحمض النووي الريبي. التربسينايسي أحادي الطبقة من الخلايا BHK-21 (أو BSR-T7 الخلايا)، والبذور 7.5 × 10 5 خلايا في طبق قطره 35 مم في وسائل الاعلام نمو للمضادات الحيوية حرة واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 10٪ بين عشية وضحاها 2. مضاعفة كمية من الخلايا في كل لوحة إذا كان يجري التخطيط لtransfections لنفس يوم البذر، وتسمح للخلايا على الانضمام إلى لوحة لمدة 2-3 ساعات في 37 درجة مئوية مع 10٪ CO 2. لاحظ أن الخلايا الأخرى التي هي مناسبة لهذا النهج وتشمل خلايا 293T الإنسان، والإنسان خلايا سرطان الخلايا الكبدية Huh7 والقرد الأخضر الأفريقي Cos7 الخلايا. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا واستبدالها مع 3 مل من وسائل الاعلام من دون مضادات حيوية جديدة لضمان أقصى قدر من الكفاءة من ترنسفكأيشن. يعد خليط من 1-2 ميكروغرام من نص MNV توج إلى 100 ميكروليتر من غروب-MEM (إينفيتروجن)، ومزجها مع 4 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 مختلطة سابقا في 100 ميكروليتر من غروب-MEM. خلط العينة بشكل دقيق من قبل pipetting انها صعودا وهبوطا 15 مرة. تركالخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة مجمعات ترنسفكأيشن التي تحتوي على النصوص توج MNV بطريقة الإفلات من الحكمة لأحادي الطبقة الخلية ويهز بلطف لوحة في اتجاهات متعامدة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 لمدة 24 إلى 72 ساعة. بعد ذلك، وإطلاق سراح virions المعدية من الخلايا عن طريق تجميد والذوبان، وتحديد عيار الفيروس عن طريق فحص لوحة أو TCID50. وبلغت عائدات نموذجية من حوالي 1 × TCID50/ml 6 10. 2. مباشرة استرداد MNV المعدية من [كدنا] في خلايا تعرب عن T7 رنا بوليميراز ويهدف هذا البروتوكول للسماح للانتعاش من MNV في الخلايا عن طريق النسخ من بايواء البلازميد المعدية الكامل [كدنا] تسلسل الجيني من قبل بوليميريز T7 التي أعرب عنها في الخلايا. ويمكن استخدام خطوط مختلفة من الخلايا لاسترداد MNV المعدية عن طريق هذا النهج على الرغم من أننا عادة الحصول على أعلى غلة مع BHK-21 واوربا BSR-T7LLS 15. نحن عادة استخدام BSR-T7 الخلايا لأنها تنمو أسرع من خط الوالدين استنساخ BHK. يصاب الخلايا مع الترميز (FPV) لجدري الطيور بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 (FPV-T7) 18 الذي يعتبر بمثابة فيروس المساعد لدفع التعبير من الحمض النووي الريبي الفيروسي وانتعاش لاحق من الفيروسات المعدية (الشكل 4). على الرغم من أن BSR-T7 الخلايا constitutively صريحة بوليميريز الحمض النووي الريبي T7، هذا التعبير ليس كافيا لانقاذ MNV المعدية بعد ترنسفكأيشن من pT7: MNV 3'Rz في غياب المساعد FPV-T7. في حين أن عائدات نموذجي من هذا النظام لا يقل عن 10 أضعاف أقل من تلك المذكورة أعلاه، فإن هذا النهج لا توفر وسيلة سريعة من المسوخ فحص للسماح لتحديد الطفرات المنهكة. وعادة ما يتم استخدام هذه الطريقة الأولى لتقييم جدوى تأنشا [كدنا]. ينبغي أن يكون بناء إما تفشل في إنتاج فيروس معد أو ويبدو أن تسفر عن فيروس عند مستويات أقل من ذلك من استنساخ نوع البرية المعدية، ثم القائمة على الحمض النووي الريبي approaويجري الفصل المذكورة أعلاه. Trypsinise أحادي الطبقة من الخلايا BHK-21 (أو BSR-T7 الخلايا) والبذور 7.5 × 10 5 خلايا في طبق 35 ملم مضاد حيوي في نمو وسائل الاعلام الحرة واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 بين عشية وضحاها. إضافة مضاعفة كمية من الخلايا في كل لوحة إذا كان يجري التخطيط لtransfections لنفس يوم البذر، وتسمح للخلايا على الانضمام إلى لوحة لمدة 2-3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية وإضافة 700 ميكرولتر من FPV-T7 إلى كل بئر (الشكل 4). يستخدم عادة لتعدد العدوى (وزارة الداخلية) من خلية ~ PFU 0.5 في، على أساس المعايرة في الابتدائي الليفية جنين الدجاج،. لكن تجدر الإشارة إلى أن يتم التحضير وظيفيا معاير جديدة من فيروس المساعد تزرع في الخلايا الليفية الأولية لتحديد الجرعة المطلوبة لاسترداد فيروس فعالة. وقد تم بروتوكولات لنشر والمعايرة من FPV-T7 الموصوفة سابقا 18. فيcubate عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 لمدة 1 ساعة للسماح FPV-T7 لتصيب الخلايا. ثم، أضف 2 مل من المضادات الحيوية مجانا DMEM تحتوي على السفح 10٪ واحتضان خلايا لمدة ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 للسماح T7 التعبير بوليميريز الحمض النووي الريبي. على المضي قدما في ترنسفكأيشن من البلازميد المعدية، وإزالة أولا وسائل الإعلام من الخلايا المصابة، تغسل مع 2 مل من وسائل الاعلام (FCS 10٪ في DMEM مجانا المضادات الحيوية)، وتغطي في النهاية أحادي الطبقة الخلية مع 3 مل من وسائل الاعلام. لا ينبغي أن المضادات الحيوية يمكن ان تضاف الى وسائل الاعلام نظرا لأنها قد تتداخل مع كفاءة Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن). إعداد مزيج من 1 ميكروغرام من النوع البري MNV [كدنا] المعدية البلازميد (على سبيل المثال pT7: MNV 3'Rz) في 100 ميكروليتر من غروب-MEM (إينفيتروجن)، ومزجها مع 4 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن) مختلطة سابقا مع 100 ميكرولتر من OPTI-MEM (إينفيتروجن). خلط رد فعل جيدا من قبل pipetting ذلك صعودا وهبوطا 15 مرة والحفاظ على هذا المزيج في غرفة تيمبيrature لمدة 20 دقيقة. وينبغي أن يؤدي هذا المزيج ترنسفكأيشن ثم اضاف لأحادي الطبقة خلية قطرة من الحكمة، وينبغي أن لوحة اهتزت بلطف في اتجاهات متعامدة. احتضان المصاب FPV-T7، MNV البلازميد-transfected الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 لمدة 24 إلى 72 ساعة. خلايا transfected مع pT7 البلازميد المعدية: MNV 3'Rz تجعل عادة titres من 1 × 10 TCID50/ml العاشر 4-5 أبريل 10. 3. ممثل النتائج على حد سواء عكس نهج الوراثة ذات كفاءة عالية لاستعادة MNV المعدية في زراعة الخلايا كما هو موضح في الشكل 5. يتم استرداد MNV المعدية مع titres تتجاوز 10 5 TCID50/ml في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن من الحمض النووي الريبي MNV توج في Raw264.7 الخلايا. وبالمثل، فإن ترنسفكأيشن من pT7 البلازميد المعدية: MNV 3'Rz إلى BSR-T7 الخلايا المصابة سابقا مع المساعد FPV معربا عن T7 (FPV-T7) أدى إلى titres الفيروسية إلى حد كبير exceeقرع 10 4 TCID50/ml (الشكل 5). هذه القيم عيار الفيروسية التي تم الحصول عليها مع الحمض النووي الريبي الاصطناعية وجزيئات الحمض النووي مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في transfections الطبيعية التي تنطوي على VPG المرتبطة الحمض النووي الريبي معزولة عن virions المعدية في نفس الخلايا (الشكل 5). هذه النتائج تسلط الضوء على الكفاءة العالية للنهج الوراثة العكسية وصفها هنا لاسترداد محددة وراثيا المتغيرات MNV في ثقافة الخلية. الشكل 1. توضيح من الجينوم MNV والبلازميد لاسترداد الفيروسات المعدية. تمثيل، رسم تخطيطي للMNV منظمة الجينوم. ويتضح كل بروتين الترميز المنطقة مربع أبيض واحد. ويترجم ORF1 إلى 7 من البروتينات غير البنيوية المختلفة (NS1 / 2 إلى NS7) التي تم إصدارها من polyprotein السلائف بعد الذاتي بروتين التجهيز. ORF 2 بترميز بروتين قفيصة الرئيسية VP1، ORF 3 بترميز قبعة صغيرةSID بروتين VP2، ومتداخلة مع ORF4 ORF2 منطقة ترميز بترميز عامل الفوعة VF1. RNAs والجينومية وsubgenomic تحتوي على ذيل polyA في تاريخ 3 بلدانهم من طول متغير. (ب)، التي تحتوي على البلازميد MNV [كدنا] المستخدمة في نهجنا الجينية العكسية (pT7: MNV 3'Rz). وتنصهر MNV [كدنا] إلى ذيل polyA من 26 المخلفات في نهاية 3 لها ". يقع تسلسل MNV [كدنا] المصب على الفور من سلسلة اقتطاع المروج T7، للسماح للT7 يحركها النسخ، والمنبع لNhe فريد أنا الموقع وتسلسل الحمض النووي الترميز لribozyme الذاتي الشق بعد ذلك. هذه المتتاليات هي أداة لضمان إنهاء نسخ الحمض النووي الريبي بعد الحق الحاضر الجينومية ذيل polyA في نهاية 3 '. الشكل 2. وlinearised MNV 3'Rz المصب على الفور: نظرة عامة على بروتوكول لاسترداد MNV المعدية من الحمض النووي الريبي كتب وتوج في المختبر وpT7 البلازميد.من تسلسل الجينوم MNV باستخدام انزيم Nhe تقييد الأول (الخطوة 1). بعد تنقية الحمض النووي، ويتم إنشاؤها MNV نسخ الحمض النووي الريبي في المختبر باستخدام T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي (الخطوة 2). منتجات النسخ تشغيل عادة مع الحركة واضح من 3KB 2.5-على عدم تبديل طبيعة 1٪ الاغاروز هلام (الخطوة 3، الشكل 3). يتم التخلص من الحمض النووي باستخدام قالب تجاري ريبونوكلياز خالية الدناز. يتم تنقيته ثم الحمض النووي الريبي من النيوكليوتيدات مجانا من هطول الأمطار LiCl (الخطوة 4). المنتج الحمض النووي الريبي المطهرون قد يكون في المختبر ثم توج بعد تسخينها في السابق عند 65 درجة مئوية إلى تتكشف الثانوية هياكل الحمض النووي الريبي (الخطوات 5-6). بعد تنقية بالترسيب LiCl، وtransfected الحمض النووي الريبي في الخلايا Raw264.7 إما (النيون نظام ترنسفكأيشن، إينفيتروجن) أو BSR-T7 الخلايا (Lipofectamine 2000، إينفيتروجن) (الخطوات 7-8). مرة واحدة داخل الخلية، وسوف تتم ترجمة النصوص توج الجيش الملكي النيبالي في البروتينات الفيروسية التي من شأنها حفز الفيروسية نسخ المتماثل إلى جزيئات الحمض النووي الريبي جديد MNVتحتوي على جزيء VPG المناسبة في نهاية 5 بلدانهم. ودورات متعاقبة من تكرار يرافقه من ترجمة الفيروسية توليد أعداد كبيرة من الجينوم الفيروسي الذي سيتم encapsidated لتوليد virions المعدية. لتسهيل الافراج عن الفيروس من الخلايا، يتم تنفيذ واحد أو عدة دورات من تجميد والذوبان (الخطوة 9). ويمكن تحديد عائدات الفيروسية ثم بواسطة TCID50 أو إجراءات فحص اللوحة. الشكل 3. تحليل سلامة MNV نسخ الحمض النووي الريبي على البروتوكول. توليف النزاهة، من الحمض النووي الريبي MNV في المختبر. وlinearised أولا MNV 3'Rz باستخدام انزيم Nhe تقييد الأول: pT7 البلازميد. بعد تنقية الحمض النووي، ويتم إنشاؤها MNV نسخ الحمض النووي الريبي في المختبر باستخدام T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي (حارة 2). الحمض النووي الريبي هو ثم purifi إد من النيوكليوتيدات مجانا من هطول الأمطار LiCl (حارة 3). يتم تشغيل منتجات النسخ على مادة هلامية غير تبديل طبيعة الاغاروز 1٪ في موازاة 1-كيلو بايت سلم الحمض النووي (نيو انغلند Biolabs، لين 1). الحركة النسبية للمحاضر الفيروسية في ظل ظروف غير تبديل طبيعة مشابهة للمنتج dsDNA من 2،5-3 كيلو بايت. B، النزاهة النصوص الحمض النووي الريبي MNV بعد السد. ويتعرض المحاضر MNV تنقيته من قبل هطول الأمطار LiCl (حارة 2) إلى وضع حد أقصى الأنزيمية (حارة 3)، وتنقية من قبل هطول الأمطار LiCl (حارة 4). C، والتحليل في رقاقة الحمض النووي الريبي اجيلنت نانو 6000 من محاضر MNV (المسار الثاني)، والنصوص MNV توج (الخط الثالث) والتي تم عجلت سابقا في LiCl. يتم تشغيل سلم ssRNA بشكل متواز. = "pdflinebreak"> الشكل 4. نظرة عامة على بروتوكول لاسترداد MNV المعدية من [كدنا]. في البداية، ويصاب BSR-T7 (أو BHK) الخلايا مع فيروس جدري الطيور المؤتلف (FPV) معربا عن بوليميريز الحمض النووي الريبي عاثية T7 (FPV-T7) (الخطوة 1). يتم تحضين الخلايا المصابة لمدة 2 ساعة قبل تلقي مزيد من العلاج للسماح للتعبير عن البروتينات FPV الذي يتضمن المؤتلف بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 (الخطوة 2). بعد ذلك، pT7: يتم transfected MNV 3'Rz في الخلايا باستخدام Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن) (الخطوة 3). مرة واحدة داخل الخلية، pT7: معترف بها من قبل MNV 3'Rz بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 الذي تم تلخيصه MNV نسخ الحمض النووي الريبي (الخطوة 4). وجود تسلسل δ-Ribozyme الذاتي في الانفطار 3'end من الجينوم يضمن ر 3 نسخة "يقع erminus فقط بعد الذيل polyA (الخطوة 5). وتوج intracellularly بعض النصوص الفيروسية بواسطة انزيم FPV متوجا (الخطوة 6). وستتم ترجمة النصوص الناتجة MNV توج لتوليد البروتينات MNV الأمر الذي سيحفز MNV النصوص النسخ المتماثل. وتوليفها حديثا MNV جزيئات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على جزيء VPG المناسبة في نهاية 5 من "الخضوع لدورات متعاقبة من تكرار يرافقه ترجمة الفيروسية التي قد تؤدي في النهاية في توليد فيروس encapsidated المعدية. لتسهيل الافراج عن الفيروس من الخلايا، يتم تنفيذ واحد أو عدة دورات من تجميد والذوبان (الخطوة 7). ويمكن تحديد عائدات الفيروسية ثم بواسطة TCID50 أو إجراءات فحص اللوحة. الشكل 5. النتائج الممثل من titres فيروس تم الحصول عليها من الوراثة عكس مختلف الأساليب المذكورة في النص. أشرطة رمادية تمثل titres فيروس الحصول على 24 ساعة بعد النيون-ترنسفكأيشن من 2 × 10 خلايا Raw264.7 6، أو بعد يبو-ترنسفكأيشن من 2 × 10 خلايا BSR-T7 6 مع الحمض النووي الريبي في المختبر وتوج MNV المحولة. أشرطة بيضاء تمثل عيار الفيروس التي تم الحصول عليها عادة بعد lipofection من pT7: MNV 3'Rz (MNV [كدنا]) إلى 2 × 10 6 BSR-T7 الخلايا المصابة سابقا لمدة 2 ساعة مع فيروس جدري الطيور معربا عن المؤتلف بوليميريز T7 (FPV-T7). كعنصر تحكم إيجابية للترنسفكأيشن إلى الخام وT7cells BSR، نحن عادة استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا المصابة مع MNV التي تحتوي على مستويات عالية من الحمض النووي الريبي MNV VPG المرتبط. وقد نفذت الضوابط السلبية خارجا مع الحمض النووي الريبي MNV أو pT7: MNV 3'Rz ترميز طفرة انزياح الإطار (F / S) الذي يلغي تكرارها، مما أدى إلى عدم اكتشاف فيروس (لا تظهر البيانات).
Discussion
هنا قد بينت أننا مختلفين النهج الوراثية العكسية التي تسمح للانتعاش من MNV المعدية في زراعة الخلايا. كلا النهجين على نحو فعال تجاوز الشرط المطلق للربط تساهمي من VPG إلى نهاية 5 'من الجينوم الفيروسي RNA عن طريق توليد النصوص MNV المغطاة التي يتم التعرف عليها بعد ذلك من قبل ريبوسوم الخلوية. في النسخ المختبر يليه السد إنزيمي هو أكثر كفاءة في انتعاش MNV المعدية من النسخ من البلازميدات المعدية في الخلايا معربا عن T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي، والتي يمكن أن توج على محاضر من الانزيمات FPV متوجا. titres فيروس تعافى مع هذه النظم الهندسة الوراثية المعكوسة هي مماثلة لتلك التي حصلت عليها ترنسفكأيشن من الحمض النووي الريبي VPG المرتبطة الفيروسية تنقيته من مزارع الخلايا المصابة 17 (الشكل 5). وترنسفكأيشن من الحمض النووي الريبي MNV توج في الخلايا Raw264.7 متساهل يجعل 1 عيار الفيروس فقط 1-سجل أقل من التجارب التي تنطوي على transfectioن من الحمض النووي الريبي من مجموع الخلايا المصابة التي تحتوي على فيروسات VPG المرتبطة الحمض النووي الريبي (الشكل 5). هذا الواقع يشجع على اجراء مزيد من التحقيقات لتحديد ما إذا كان بالإضافة إلى ذلك من جزيء VPG إلى نهاية 5 'من النصوص التي تولدها هذه النظم يمكن أن يؤدي إلى زيادة غلة فيروس والتي قد تكشف عن الجوانب الفنية الكامنة وراء MNV العدوى في الخلايا المرتبطة VPG. ومع ذلك، فإننا نعتبر هذا نظام الوراثة العكسية باعتبارها واحدة ذات كفاءة عالية مقارنة للفيروسات الحمض النووي الريبي عكس غيرها من النظم المستخدمة حاليا في علم الوراثة الذي في الحمض النووي الريبي المختبر المحولة يسمح للانتعاش من titres فقط 10-100 في أقل من التهابات حقيقية مع virions 19 و 20.
وعموما، فإن المنهجيات الحالية تشكل خطوة كبيرة إلى الأمام في مجال البيولوجيا الجزيئية ونوروفيروس توفر لنا الأدوات اللازمة للتحقيق في الأدوار الوظيفية للبروتينات وحفظها الزخارف في الحمض النووي الريبي الجينوم نوروفيروس. وقد تم بالفعل هذه المناهج جنبا إلى جنب مع جurrent الفأر نموذج المتاحة، وأظهرت أن MNV تعافى من [كدنا] المعدية هي قادرة على أن تسبب عدوى قاتلة من> 80٪ STAT1 / – الفئران في أقل من 10 أيام 4 و 21. الاستفادة من هذا النظام انتشلنا قابلة للحياة المسوخ نوروفيروس الفئران من البروتين قفيصة والمسالك polypyrimidine المشاركة في ملزم من العوامل المضيف مختلفة (PTB وPCBP) التي تعرض الظواهر الموهن إلى حد ما في الجسم الحي 21 و 22. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن الفيروسات التي تفتقر إلى القدرة على التعبير عن هذا البروتين VF1 من ORF4 بكفاءة تكرار في ثقافة الخلية ولكن مرة أخرى قد خفضت الفوعة في الفئران فيما يتعلق MNV WT 8. هذه الدراسات تشجيع لنا لتصميم إصدارات الموهن من noroviruses الإنسان على أساس دراسات MNV التي يمكن أن يتم التحقيق في مثل اللقاحات المرشحة المحتملة.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الزمالة ويلكوم تراست التي منحت لكبار Goodfellow إيان، وماري كوري البينية الأوروبية زمالة (FP7 مجلس البحوث الأوروبي) التي منحت لأرياس ارماندو. نود أن نشكر ايو كونغ تشيونغ، الدكتور روباي ريبيكا والدكتور الدباغ مايك لمنحنا الإذن لاستخدام هذه اجيلنت bioanalyser والمساعدة في تشغيل عينات من الحمض النووي الريبي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lithium chloride precipitation solution | Ambion | AM9480 |
| RNA storage solution | Ambion | AM7000 |
| MEGAscript T7 script | Ambion | AM1333 |
| ScriptCap m7G Capping System | Epicentre Biotechnologies | SCCE0610 |
| Neon transfection system | Invitrogen | MPK5000 |
| Neon transfection system kit | Invitrogen | MPK1025 |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985070 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-027 |
| Agilent RNA 600 Nano kit | Agilent | 5067-1511 |
| Agilent 2100 bioanalyzer | Agilent | G2939AA |
| Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | GE Healthcare | 28-9034-70 |
| RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 | Promega | P1300 |
Referenzen
- . Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships–United States. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).
- Lopman, B. A. Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003. Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).
- Duizer, E. Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).
- Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus. Science. 299, 1575-1575 (2003).
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Bok, K. Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5′-end of the genome. Virology. 380, 328-337 (2008).
- Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection. Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).
- McFadden, N. Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4. PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).
- Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. Non-viral heterogeneous sequences at the 5′ ends of tomato spotted wilt virus mRNAs. J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).
- Shuman, S., Hurwitz, J. Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme–guanylate intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).
- Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 44, 292-309 (1990).
- Chaudhry, Y. Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components. J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4. E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).
- Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).
- Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).
- Ward, V. K. Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).
- Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).
- Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS One. 5, e10735 (2010).
- Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).
- Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).
- Bailey, D. Functional analysis of RNA structures present at the 3′ extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence. J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).
Diesen Artikel zitieren
Arias, A., Ureña, L., Thorne, L., Yunus, M. A., Goodfellow, I. Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus. J. Vis. Exp. (64), e4145, doi:10.3791/4145 (2012).