Een protocol voor de voorbereiding van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten wordt beschreven. Dit protocol is waardevol voor testen die het gebruik van kleine populaties van cellen, zoals cellen behandeld met medicijnen of RNAi vereisen. De methode moet voor diverse genexpressie assays en andere celtypes, die onder andere cellen.
Een groot deel van de vooruitgang in het begrijpen van gen-expressie is gemaakt met behulp van in vitro systemen. Voor de meeste onderzoeken zijn functionele bepalingen uitgevoerd met extracten die in bulk bereid 10-50 of meer liter cellen gekweekt in suspensie. Echter, deze grote preparaten niet vatbaar zijn voor snel in vitro testen die het gevolg is van verschillende in vivo behandeling of cellulaire voorwaarden. Dit blad video artikel wordt een werkwijze voor het bereiden functionele kleine kernextracten met HeLa-cellen als voorbeeld. Deze werkwijze wordt uitgevoerd met slechts drie platen 150 mm van cellen gekweekt in aanhangend monolagen. Om de efficiëntie van de kleinschalige extracten te illustreren, laten we zien dat ze zo actief zijn als bulk nucleaire extracten voor gekoppelde RNA-polymerase II de transcriptie / splicing reacties. Om het nut van het extract protocol aan te tonen, laten we zien dat splicing wordt afgeschaft extracten bereid uit HeLa cels die werden behandeld met de splicing inhibitor drug E7107. De kleinschalige protocol dient te worden over het algemeen van toepassing zijn op een proces of celtype dat kan worden onderzocht in vitro met behulp van cellulaire extracten. Deze omvatten patiënt cellen die slechts in beperkte hoeveelheden of cellen blootgesteld aan verschillende middelen, zoals drugs, DNA beschadigende middelen RNAi of transfectie, wat het gebruik van kleine celpopulaties vereisen. Bovendien kleine hoeveelheden vers gekweekte cellen gemakkelijk en / of voor sommige toepassingen.
Wij hebben een snelle en reproduceerbare wijze voor de bereiding van nucleaire extracten van kleine hoeveelheden van HeLa-cellen gekweekt als monolagen. We hebben aangetoond dat deze extracten zijn robuust door te laten zien dat de kinetiek en de efficiëntie van RNAP II transcriptie / splicing tests zijn vergelijkbaar in de kleinschalige en bulk nucleaire extracten. We hebben aangetoond het nut van de extracten door te tonen dat extracten verkregen uit cellen behandeld met een vertakkingsschotel inhibitoren actief zijn voor transcriptie maar gebrekkig splicing.
De werkwijze voor het bereiden kleine kernextracten werd door het combineren en optimaliseren methoden eerder voor het maken extracten van HeLa-cellen gekweekt in suspensie in grote 1,8 en een werkwijze voor kleinschalige bereiden van extracten 9. We stelden ons protocol omdat de vorige kleine fragmenten niet functioneel enige assays, zoals gekoppelde transcriptie / splicing assay. Een belangrijk verschil tussen de vorige kleinschalige protocol 9 en de onze is dat we voorwaarden voor het lyseren cellen met behulp van een mini-Dounce geoptimaliseerd terwijl het vorige protocol gelyseerd cellen door ze door middel van een kleine naald 9. De naald-lyse resulteert in bubbels, wat kan verklaren waarom de extracten niet actief zijn geweest en / of moeilijk te reproduceren voor sommige testen. We hebben ook een concentratiestap onze protocol. Deze stap verhoogt de activiteit van de extracten die zeer gevoelig concentratie en beperkt de verschillen tussen extracten die inherent is aan kleine preparaten. Tenslotte wordt onze voorbereiding routinematig uitgevoerd met slechts drie 150 mm platen van monolaag cellen, zonder enig significant effect op de activiteit in vergelijking met bulk-extracten. Zo is de procedure gemakkelijk vatbaar voor kleinschalige bereidingen die dure reagentia of beperkte cel beschikbaarheid vereisen. Zo hebben wij bereid small-schaal extracten van RNAi knock-down-cellen en van chronische lymfatische leukemie (CLL) patiënt cellen, en deze producten worden gebruikt voor functionele en / of biochemische assays (EGF, JLH, TY en RR, niet gepubliceerd). Wij hebben gevonden dat de extracten belangrijk is voor RNAi door specifieke biochemische assays zoals immunopreciptations, Westerns, en zilverkleuring. Na het bepalen van de werkzaamheid van slopen een bepaalde proteïne een meer gedetailleerde studie uitgevoerd door een stabiele knockdown cellijn, die kan worden gebruikt om extra extracten bereid tegen lagere kosten. Massaspectrometrie eiwitten presenteren immunoprecipitaten verkregen deze knockdown cellijnen ook een nuttige toepassing van de werkwijze. Naast de gekoppelde transcriptie / splicing assay dat we als voorbeeld voor onze protocol beschrijving hier dient de kleine fragmenten in het algemeen van toepassing op vele functionele en biochemische onderzoeken, zoals die voor de verschillende steps in genexpressie (bijvoorbeeld aftopping, lassen, transcriptie, polyadenylatie, microRNA verwerking). Het protocol kan worden aangepast voor de patiënt celtypes die kan worden verkregen suspensie (zoals CLL cellen) of in kweek (zoals fibroblasten patiënt). Tenslotte moet het cytoplasmatische fractie verkregen tijdens de procedure nuttig voor functionele biochemische onderzoeken dat het cytoplasma vereisen.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar aan M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng voor nuttige discussies. HeLa-cellen werden verkregen uit de Nationale Cultuur van de Cel Center (Minneapolis, MN). We danken ook Eisai Co, Ltd voor het leveren van E7107 en de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School voor hulp bij lichtmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie GM043375 aan RR en EGF en NRSA gemeenschap te JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.