Геномная Трансформация Picoeukaryote<em> Ostreococcus Тельца</em

1. Подготовка материала водорослей Ostreococcus клетки культивируют в искусственной морской воде (ASW). Морской соли (обычно около 40 граммов на литр), растворяют в дистиллированной воде с соленостью 30 п.п., а измеряется с помощью солености метр. Обогащение средней 11,12, микроэлементы металлов и витамины добавляются как описано в таблицах 1-3. Средства массовой информации, то фильтр стерилизовать через 0,22 мкм фильтр. Для обеспечения, клетки Ostreococcus штамм OTTH95 суб-культурных асептически в разведении 1/100 в свежих ASW каждые 7 дней и вырос под постоянным светом в рост растений инкубатор оснащен Moonlight синий фильтр. Интенсивность света должна быть близка к 20 мкмоль м -2 с -1, а температура поддерживается на уровне 20 ° C. Клетки не требуют постоянного волнения, но потрясен каждые 2 до 3 дней для предотвращения агрегации. Для каждой трансформации, 50 мл клеток необходимы в клетке-де-nsity 20-30 х 10 6 мл -1, которые должны быть достигнуты через 5-7 дней после высеве. Приблизительная плотность клеток и axeny может быть определена с использованием либо проточной цитометрии или гемоцитометра как минимум увеличение x40. 2. Электропорация Подготовка ДНК для трансформации. Для каждой трансформации, 5 мкг чистого линеаризованной плазмиды ДНК требуется при концентрации 1 мкг / мкл стерильной дистиллированной водой. Чтобы получить эту ДНК, авторы рекомендуют использовать Qiagen миди подготовительные комплект, хотя и другими методами может работать одинаково хорошо. Дайджест продукта с ферментом, который режет в основной вектор использовать, но не в трансгенов или выбор ген. Далее очищать и концентрировать полученной линейной ДНК осаждением этанолом, и ресуспендируют продукт в соответствующем объеме высококачественного стерильной дистиллированной водой. Подготовить микроцентрифужных пробирок, содержащих 5 мкг ДНК для каждого преобразования. Controл с ДНК не является необходимым для каждой клеточной линии должны быть преобразованы. Храните эти трубы на льду, вместе с 2 мм электропорации кюветы для каждого преобразования. Подготовить 2,2 мл буфера ресуспендирования в преобразовании. Растворите Сорбит в 1 М раствор в DDH 2 O, добавить 0,1% плуроник кислоты F68 и фильтр-стерилизации. Добавить плуроник кислоты F68, до конечной концентрации от 0,1% до клетки и гранул их в течение 10 минут 8000X г при 10 ° С в 50 мл трубки с коническим дном. Сразу ресуспендирования клеток в 1 мл ресуспендирования буфера с помощью пипетки вверх и вниз, и передать микроцентрифужную трубку. Спином вниз в течение 10 минут при 8000 х г при 10 ° С, а работать быстро, повторите этот шаг мыть еще раз. В разрезе наконечник, ресуспендируют каждый конечный осадок в 40 мкл буфера ресуспендирования. Добавить 40 мкл ресуспендированного клеток каждый трубку линеаризованной ДНК на льду, аккуратно перемешать и передать электропорации кюветы. Поместите кювету в electropречь машине. Изменение параметров до 6 кВ см -1, 600 Ω и 25 мкФ. Electroporate клеток. Инкубируйте electoporated клеток в кювет при комнатной температуре в течение 10 минут, а использовать это время для подготовки колбы культуре ткани. Назовите их и добавить 30 мл свежего ASW каждому. Принимать по 1 мл из каждой колбы и осторожно добавить его к соответствующей кюветы. Выдержите в течение 2 минут и осторожно удалите ASW, теперь содержащие глобулы клеток и медленно и осторожно пипетировать непосредственно в ASW в культуре колбу. Клетки обычно остаются в глобулы. Будьте осторожны, не трясите и не нарушать агрегированных клеток в данный момент. Дайте клеткам восстановиться в инкубаторе в течение 1-2 часов, затем ресуспендируют путем встряхивания колб. В это время клетки должны ресуспендируют свободно и без скопления должны быть видны. Оставьте культур для восстановления в течение ночи в инкубаторе. 3. Включение Ячейки плит в полу-твердые среднего <lя> На следующий день, автоклав раствор 2,1% с низкой температурой плавления агарозы в DDH 2 O во флакон, содержащий перемешивании стержня. Имейте в расплавленном 65-90 ° С в больших стакан с водой на отопление магнитной мешалкой. Для каждого преобразования подготовить 8 чашек Петри (55 мм) и 8 х 15 мл пробирок в каждом из которых 9 мл ASW плюс необходимый выбор. При использовании нурсеотрицина или G418, использовать 2 мг / мл. Соберите трансформированные клетки из инкубатора. Работа в стерильных flowhood, добавить 1 мл кипящей LMP агарозы в 9 мл в одной из труб. Закройте трубы, и смешивать обращением. Затем добавить 0,5 мл свежей трансформированных клеток, быстро перемешать и вылить в тарелку. Повторите этот процесс с оставшимися 7 труб, а затем переходите к следующему колбу трансформации. Оставьте пластин открыть в потоке капот в течение часа, для агарозы, чтобы установить. Затем закройте плиты и переносить их на большие квадратные чашки Петри, которая состоится 4 пластин в каждой. Печать площади остроумие пластинч парафильмом. Следует отметить, что пластины не будет устанавливать полностью, и, как следствие, гель очень хрупкая. Следует проявлять осторожность, чтобы не сломать гель при обработке пластин. Поместите все квадратные плиты в инкубаторе. 4. Выбор трансформированных колоний Колонии должны появиться после 10 до 21 дней на преобразование пластин, а не на макете преобразован пластин. Чтобы выбрать колоний используют 200 мкл пипетку с запорными советы. Просто выберите свободный колониями и высасывают зеленые колонии. Будьте осторожны, чтобы не включать любые клетки из соседних колоний. Передача клеток по 2 мл жидкой среды, содержащей выделения, в 24 пластин скважин. При использовании нурсеотрицина, используйте 1,75 мг / мл. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Выберите 24-50 колоний на преобразование. Уплотнение пластин с парафильмом и трансфер в инкубаторе. Через неделю, передавать по 100 мкл в каждую лунку по 2 мл свежего ASW с выбором в 24 пластин скважин и расти additionaл 7 дней. Выжившие клеточные линии могут быть использованы для дальнейших исследований. Стабильная интеграция в число генома и вставки должны быть проанализированы с помощью ПЦР и Южной Blot. Геномная ДНК могут быть получены для этих целей с помощью любого вниз масштабных стандартный метод выделения ДНК растения. 5. Представитель Результаты Клетки разделены 1/100 достигли плотности 25 миллионов клеток на миллилитр, увеличившись на 7 дней. Электропорация клеток с соответствующими параметрами в результате постоянной времени от 10 до 14 миллисекунд. Когда клетки переносятся в среду в области культуры фляги, глобулы клетки должны сформироваться. Когда слегка потряс через час, клетки должны легко ресуспендирования. Включение 1 мл трансформированных клеток в 0,2% LMP агар должно привести к последовательной, но только полутвердый гель. Колонии должны появиться после 10 до 21 дней. При преобразовании 5 мкг линеаризованной ДНК с использованием протокола выше, 50-100 колоний на преобразованиеплита, как правило, ожидается, по сравнению с ни на отрицательные пластины контроля. ~ 80% колоний взял положительно выбран устойчивости к антибиотикам в жидкой среде и были использованы в последующих исследованиях. Конечная концентрация Основной раствор Объем за 1 литр NaNO 3 8,83 х 10 -4 М 75 г / л дН 2 O 1 мл NH 4 Cl 3,63 х 10 -5 М 2,68 г / л дН 2 O 1 мл β-глицерофосфата 1 х 10 -5 М 2,16 г / л дН 2 O 1 мл H 2 SeO 3 1 х 10 -8 М 1,29 мг / л дН 2 O 1 мл Трис-основание (рН 7,2) 1 х 10 -3 М 121,1 г / л дН 2 O 1 мл К следов металла решения Таблица 2 1 мл е / 2 витамин решение Таблица 3 0,5 мл Таблица 1. Средние составляющие для роста О. 11 Тельца, 12. Составьте общий объем 1 литра искусственной морской воды с соленостью 30 п.п., а также добавлять компоненты со склада выше решения, как указано. Фильтр-стерилизации среды и использования в течение недели. Акции всех соединений, кроме решения витамина могут быть объединены, чтобы добавить 6 мл этого раствора на каждый литр среды. Конечная концентрация Основной раствор Сумма за 1 литр Na 2 </sиь> ЭДТА • 2H 2 O 1 х 10 -4 М 41,6 г FeCl 3 • 6H 2 O 1 х 10 -5 М 3,15 г Na 2 MoO 4 • 2H 2 O 1 х 10 -8 М 6,3 г / л дН 2 O 1 мл ZnSO 4 • 7H 2 O 1 х 10 -9 М 22,0 г / л дН 2 O 1 мл CoCl 2 • 6H 2 O 1 х 10 -9 М 10,0 г / л дН 2 O 1 мл MnCl 2 • 4H 2 O 1 х 10 -8 М 180,0 г / л дН 2 O 1 мл CuSO 4 • 5H 2 O 1 х 10 -8 М 9,8 г / л дН <sub> 2 O 1 мл Таблица 2. Трассировка металл решение 11,12. Макияж в общей сложности 1 литр, в дН 2 O, и тепло, чтобы раствориться. Алиготе решение и заморозить для хранения. Окончательные концентрации указаны ссылки на окончательный средний, а не решение следов металла. Конечная концентрация Основной раствор Сумма за 1 литр Витамин B 12 1 х 10 -10 М 1 г / л дН 2 O 1 мл Биотин 1 х 10 -9 М 0,1 г / л дН 2 O 10 мл Тиамин • HCl 1 х 10 -7 М 200 мг Таблица 3. е / 2Витамин решение 11. Сделайте в общей сложности до 1 литра в дН 2 O, фильтр-стерилизации, аликвоты и заморозить. Окончательные концентрации указаны ссылки на окончательное среде, не витамин решение. Рисунок 1. Графическое представление преобразования процедуры. Схематическое изображение процедуры генетически трансформировать Ostreococcus Тельца путем электропорации. Рисунок 2. Культура роста. Клетки суб-культурных асептически в разведении 1/100 в свежих ASW каждые 7 дней и вырос под постоянным светом в рост растений инкубатор оснащен Moonlight синий фильтр. Интенсивность света должна быть близка к 20 мкмоль м -2 с -1 и поддерживается температура 20 ° С клетки не нуждаются в постоянной тревоге, но сХакен каждые 2 до 3 дней для предотвращения агрегации. Рисунок 3. Колония образования на 0,2% агарозном LMP. Передача 4 пластин большой площади чашки Петри, а печать с парафильмом (вверху слева). Когда колонии образуются, просто выделите бесплатно (в идеале конической формы), колонии (вверху справа) и сосать их из пластины с пипеткой P200. Там должно быть никаких колоний на отрицательный контроль (внизу справа).