斑马鱼的快速发展,小尺寸和透明度是先天感染的免疫控制的研究的巨大优势<sup> 1-4</sup>。在这里,我们证明斑马鱼幼虫病原真菌感染的技术<em>白念珠菌</em>通过显微注射方法最近使用的牵连吞噬细胞NADPH氧化酶活性真菌异形控制<sup> 5</sup>。
由病原体白念珠菌引起的播散性念珠菌是临床上重要的问题,在住院的个人和30到40%的占死亡率6。系统性念珠菌通常是由先天免疫控制,并与先天免疫细胞成分如巨噬细胞NADPH氧化酶的遗传缺陷的人更易患念珠菌7-9。很少有人知道关于C 的动态白念珠菌与先天免疫细胞在体内的相互作用。在体外研究中广泛建立了外部主机C.白念珠菌的巨噬细胞内发芽,迅速 摧毁了嗜中性粒细胞10-14。 在体外研究中,虽然有用,能不能概括在复杂的体内环境,细胞因子水平,细胞外基质的附件,以及10间的接触,其中包括随时间变化的动态, 15-18 </sup>。为了探讨这些因素在宿主 – 病原体相互作用的贡献,关键是找到一个模式生物,在现场的完整主机可视化的非侵入性感染的这些方面。
斑马鱼幼虫提供了一个独特的和多功能的脊椎动物宿主感染的研究。发展的斑马鱼幼虫的前30天,有先天免疫防御2,19-21,简化,如播散性念珠菌是高度依赖先天免疫疾病的研究。小斑马鱼幼虫的大小和透明度,使在细胞水平上的主机和病原体感染的动态影像。与先天免疫细胞荧光的转基因幼虫可用于识别特定的细胞类型涉及在感染22-24。修饰的反义寡核苷酸(吗啉代)可以用来击倒各种免疫成分,如巨噬细胞NADPH氧化酶研究在回应funga的变化L型感染5。除了使用小低脊椎动物的道德和实用性强等优点,斑马鱼幼虫提供了独特的图像之间的病原体和宿主在intravitally颜色的酣战的可能性。
斑马鱼已被用于模型感染人类致病细菌的数量,并一直在我们理解分枝杆菌感染,25器乐重大进展。然而,最近才具有更大的病原体,如被用于真菌感染的幼虫5,23,26,迄今没有发生过感染的方法进行了详细的视觉描述。在这里,我们提出后脑普里姆25斑马鱼心室显微注射,包括我们以前的协议的修改我们的技术。 在体外研究中我们发现真菌感染的幼虫斑马鱼模型偏离和加强需要检查主机的病原体INTERAction培养皿5简化了系统的主机,而不是在复杂的环境中。
这里的斑马鱼显微注射的方法不同于,Gutzman 等。在这里34我们展示通过注射到36至48 HPF幼虫的后脑心室耳泡。我们所描述的方法可以减少组织损伤后脑心室10-15酵母一致的注入。该协议产生的最初24 HPI( 图1)造成重大杀伤力/ 5发病,整个身体蔓延的局部感染。后脑脑室不完全封闭,直到48 HPF 27,29。在此发展的巨噬细胞和中性粒细胞的早期迁移到感染?…
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢显微注射培训,克拉丽莎亨利的意见,对加快胚胎发育和设备的使用博士卡罗尔金的实验室,和,弥敦道劳森贡献FLI1:EGFP鱼。我们感谢手稿的批判性阅读的惠勒实验室和肖恩墙成员。我们也想感谢马克Nilan鱼的保健和咨询,瑞安Phennicie和克里斯汀的Gabor在这个项目上的技术咨询。资助这项工作是由MAFES哈奇授予1 MAFES E08913-08,和国立卫生研究院的NCRR奖P20RR016463河惠勒光兄弟,研究助理。
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
Spawning tanks | Aquatic habitats | 2L | |
1.7 mL tubes | Axygen | MCT-175-C | |
Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
Extra deep Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11Z | |
Standard Petri dishes | VWR Scientific | 25384-302 | |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
Disposable Hemocytometer | VWR Scientific | 82030-468 | |
Phosphate Buffered Saline | VWR Scientific | 12001-986 | |
Dumont Dumoxel Tweezers | VWR Scientific | 100501-806 | |
Wooden Dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
KimWipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
Low Melt Agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
Agarose for injection dishes | VWR Scientific | 12002-102 | |
Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Hollow glass rods | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner |
Pipette Storage Box | Sutter Instruments | BX10 | |
MPPI-3 Injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Back Pressure Unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Micropipette Holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
Foot Switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
Magnetic Base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
Dissecting Scope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
Confocal Microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
Imaging Dishes | MatTek Corporation | P24G-1.0-10-F | |
Pipette tips for loading needles | Eppendorf | 930001007 | |
Plate pouring grids | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Heated Stage | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
Flat Spatula | VWR Scientific | 82027-486 | |
Plastic Sieves | Wares of Knutsford Online | 12 cm | |
Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
16 x 150 mm Culture tubes | VWR Scientific | 60825-435 | |
Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
Phenol Red | VWR Scientific | 97062-478 | |
HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
Ca(NO3)2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
Morpholinos | GeneTools, LLC |