중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작
Summary
이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수<em> 체외에서</em>과<em> 생체내에서</em>.
Abstract
중추 신경계 (CNS)에서 효율적인 유전자 전달 신경학적인 질병 모델링 및 치료 접근법을 개발, 유전자 기능 연구에 중요하다. Lentiviral 벡터들은 모두 분리 및 비 나누어 세포, transgenes 지원하는 지속적인 표현을 transduce으로 CNS의 뉴런과 다른 세포 유형의 형질 도입에 매력적인 도구이며, 비교적 큰 포장 용량과 낮은 독성 1-3 있습니다. Lentiviral 벡터가 성공적으로 체외 4-6에서 많은 신경 세포 유형을 transducing과 7-10 동물에 사용되었습니다.
그레이트 노력 향상된 biosafety 및 유전자 전달을위한 효율 lentiviral 벡터를 개발되었습니다. 현재 3 세대 복제 – 결함과 자기 운영을 중지시키지 (SIN) lentiviral 벡터는 그림 1에 표시됩니다. 벡터 포장을위한 필수 요소 네 가지 plasmids 나뉘어있다. lentiviral 트랜스에서플라스미드 하기까지, 5 '긴 터미널 반복 (LTR)의 U3 영역은 다른 바이러스의 강력한 모터로 대체됩니다. 이 수정은 일반적으로 HIV 유전자 발현 11가 필요합니다 HIV-1 두드리는 단백질의 벡터 시퀀스의 전사 독립 있습니다. 포장 신호 (Ψ)가 encapsidation와 레브 – 반응 요소 (RRE)에 필수적인 높은 titer 벡터를 제작할 필요합니다. 중앙 polypurine 요로 (cPPT)는 벡터 DNA의 핵 수입이 아닌 분열하는 세포에게 12 transducing에 필요한 기능을 위해 중요하다. 3 'LTR에서 CIS-규제 시퀀스는 완전히 U3 영역에서 제거됩니다. 이 삭제는 두 LTRs의 transcriptional 불활 성화 결과, 리버스 녹음 후 5 'LTR에 복사됩니다. 플라스미드 pMDLg / pRRE은 구조 단백질 및 역방향 transcriptase를 제공 HIV-1 개그 / POL 유전자를 포함합니다. pRSV – 레브 핵의 효율적인 RNA의 수출 RRE에 바인딩 레브 인코딩합니다. pCMV-G는 인코딩HIV-1 유럽 표준안을 대체 소낭성의 구염 바이러스 당단백질 (VSV-G). VSV-G는 벡터의 tropism을 확대하고 ultracentrifugation 13을 통해 집중력이 가능합니다. Vif, Vpr, VPU 및 NEF 포함한 액세서리 단백질을 인코딩 모든 유전자는 패키징 시스템에서 제외됩니다. lentiviral 벡터의 생산과 조작은 재조합 DNA (참여 연구를위한 NIH 가이드라인에 따라 실시되어야 http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf을 ). 개별 기관 생물 및 화학 안전위원회의 승인을 lentiviral 벡터를 사용하기 전에 필요할 수 있습니다. Lentiviral 벡터는 일반적으로 lentiviral 전송 플라스미드 및 벡터 포장에 필요한 단백질을 인코딩 도우미 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection에 의해 생산됩니다. 많은 lentiviral 전송 plasmids와 헬퍼 plasmids은 Addgene, 비에서 구할 수 있습니다비영리 플라스미드 보관함 ( http://www.addgene.org/~~V ). 일부 안정적인 포장 세포 라인 개발하지만, 이러한 시스템은 시간이 14여 덜 유연성과 그들의 포장 효율은 일반적으로 거부, 15을 제공하고 있습니다. 상용 transfection 키트는 transfection 16 높은 효율성을 지원할 수 있지만 대규모 벡터 준비를 위해 매우 비쌉니다. 칼슘 인산염 석출 방법 293T 세포의 효율적인 transfection을 제공하기 때문에 lentiviral 벡터 생산을위한 안정적이고 비용 효과적인 접근 방식을 제공합니다.
이 프로토콜에서는 20 %의 자당 쿠션을 통해 정화 및 ultracentrifugation와 농도이어서 칼슘 인산염 석출 원리에 기반으로 최대 4 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection로 lentiviral 벡터를 생성합니다. 벡터 titers는 형광 – 활성 셀 정렬 (FACS) 항문에 의해 결정됩니다ysis 또는 실시간 qPCR에 의한. 이 프로토콜의 lentiviral 벡터의 생산과 적정가 구일이 완료됩니다. 우리는 뉴런과 astrocytes를 모두 포함하는 murine neocortical 문화로 이러한 벡터를 transducing의 예를 제공합니다. 우리는 lentiviral 벡터 형질 도입과 CNS의 기본 교양 세포의 세포 유형의 특정 유전자 발현의 높은 효율을 지원하는 것을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
이 프로토콜에서는 neocortical 문화권에서 이러한 벡터의 lentiviral 벡터와 응용 프로그램의 제작을 보여주었다. 우리는이 방법으로 생산되는 벡터로 효율적이고 셀 유형 – 특정 형질 도입을 보여주었다. synapsin 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 엄격히 신경 세포에만 적용됩니다. GFAP 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 astrocytes에 독점적이다. 어떤 세포 유형에 특정한 표현이 필요하지 않은 경우 유비 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 워싱턴 대학, 프로그램 프로젝트 그랜트 NS032636 (BJS)에 NIH 신경 과학 청사진 코어 교부금 (P30 NS057105, BJS)와 신경계 장애에 대한 희망 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Referenzen
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
